錯配修復基因在右半結腸癌的表達對病理特征的影響

嚴萬能，馬海潔，沈朝敏

（浙江省舟山醫院a.普外科，b.細胞分子生物學實驗室，浙江 舟山 316000）

結腸直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，據2012年WHO統計數據顯示其發病率在全球列第3位，死亡率第4位[1]。中國癌癥統計數據顯示，2015年結腸直腸癌的發病率及死亡率均居全部惡性腫瘤的第5位，死亡病例19.1萬，新發病例37.6萬，發病率顯著上升[2]。因此，尋找預測結腸癌臨床病理學特征的生物學標志，從而提高診治效果、改善預后，意義重要。

1990年，Bufill[3]依據胚胎起源、生理解剖、內環境和分子生物學特征等差異提出，應以結腸脾曲為界將左、右結腸癌分成兩種不同的疾病。近年來，關于左、右結腸癌基因表達差異的研究有新的進展。研究發現，錯配修復基因（mismatch repair,MMR）是影響結腸直腸癌發病的重要分子標志，維持基因組的穩定性與高保真性，降低基因編碼過程中突變的概率[4]。MMR 包括 MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、PMS2，MLH1和 MSH2是重要的 2個基因。90%以上的MMR缺失都屬于MLH1和MSH2的缺失[5-6]。MMR基因表達缺失的機制通常是基因啟動子甲基化致表達沉默[7-9]。國外研究發現散發性結腸直腸癌中右半結腸癌出現MMR基因表達缺失的概率是左半結腸癌的10倍[10]。本研究回顧分析206例我院手術治療的散發性結腸癌 MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因的表達水平。進一步研究左半、右半結腸癌 MLH1、MSH2、MSH6和 PMS2蛋白質表達差異，探討MMR蛋白質表達缺失對右半結腸癌病理特征的影響及意義。

資料與方法

一、臨床資料

2015年1月至2020年8月我院手術治療且病理資料完整的結腸癌病例共206例。男115例，女91例。中位年齡70（32～92）歲。左半結腸癌116例，右半結腸癌90例。病人特征如下：①行外科根治手術的原發結腸癌；②病理診斷為結腸癌；③術前未行放、化療或分子靶向治療。本研究病例無家族性腺瘤型息肉病和遺傳性非息肉型結腸直腸癌。

研究指標為手術切除組織病理檢查結果：腫瘤分化程度、TNM分期、神經與脈管浸潤、淋巴結轉移。

二、MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白質表達情況

采用免疫組織化學法檢測。石蠟包埋結腸癌組織塊連續切片，厚度約4 μm。經脫蠟、抗原修復后，采用二步法染色檢測MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白質表達。一抗來自河南賽諾特生物公司（克隆號為 C12A19、G219-1129、GM024 和 EP51）。陰性對照用PBS磷酸緩沖液替代一抗。二抗采用DAKO EnVisionTM二步法，抗兔、鼠通用型免疫組織化學試劑。將顯色后的片子用清水沖洗后，浸泡于蘇木素溶液中染色30 s，完成細胞核復染。脫水后，完成封片。

三、免疫組織化學檢測結果判定

病理切片中正常腸黏膜、腫瘤間質細胞、炎癥細胞為內對照，核陽性著色。以1%為陽性界值，≥1%的腫瘤細胞核陽性著色判定為陽性，＜1%判定為陰性（見圖1）。MLH1、MSH2、MSH6 和 PMS2 的4個蛋白質中，任意一個染色為陰性即判定為MMR蛋白質表達缺失；4個蛋白質均為陽性判定為MMR蛋白質表達正常。判定過程由2位高年資病理科醫師雙盲法獨立進行。有異議的病例，提交上級醫師重新判讀。

圖1 結腸癌組織MLH1、MSH2、MSH6和PMS2免疫組組化學檢測陰性與陽性結果

四、統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。Pearson卡方檢驗、連續校正卡方檢驗和Fisher精確檢驗分析MMR蛋白質表達與結腸癌病理特征之間的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、結腸癌MMR蛋白質表達情況

右半結腸癌MMR蛋白質表達缺失12例（13.33%）。其中 MLH1 缺失 9 例（10.00%），MSH2缺失 3 例(3.33%)，MSH6 缺失3例（3.33%），PMS2缺失 9 例（10.00%）。MMR 表達陽性 78 例（86.67%）。左半結腸癌MMR表達缺失9例（7.76%），其中MLH1 缺失 6 例（5.17%），MSH2 缺失者3例（2.59%），MSH6 缺失者3例（2.59%），PMS2 缺失者6 例（5.17%），MMR 表達陽性者 107 例（92.24%）。雖然現有數據分析差異并無統計學意義，但表中結果直觀顯示右半結腸癌MMR蛋白質缺失率高于左半結腸癌（見表1）。

表1 MMR表達情況[n（%）]

二、MMR蛋白質表達與右半結腸癌病理特征的關系

90例右半結腸癌，MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白質表達與腫瘤分化程度有關（P＜0.05）。58.33%的蛋白質表達缺失病人表現為腫瘤組織病理低分化，該比例明顯高于有MMR表達病人的15.38%。5例黏液腺癌病人均有MMR表達。MMR蛋白質表達缺失的12例右半結癌病人無神經浸潤，而有蛋白質表達者約28.21%神經浸潤（P＜0.05）。右半結腸癌MMR蛋白質表達與其他病理特征無相關性（見表2）。

表2 MMR蛋白質表達與右半結腸癌病理特征的關系

討 論

國內、外研究發現，結腸直腸癌發生是在遺傳和環境因素共同作用下，多基因突變積累導致的復雜生物學演變過程。目前結腸直腸癌發生的分子生物學路徑主要分3類：微衛星不穩定、染色體不穩定和CpG島甲基化表型[11-13]。微衛星不穩定路徑是Aaltonen等[14]于1993年首次發現，由MMR突變引起的基因突變路徑。DNA復制過程中，尤其是微衛星，可能會出現堿基錯配等錯誤，累積并代代相傳，最終產生基因突變進而導致細胞癌變。DNA復制過程中產生的一些簡單重復序列的插入或缺失，導致微衛星不穩定[15-16]。因此，MMR基因缺失可能是導致結腸直腸癌發生的主要影響因子，又稱為“門衛基因”[17-18]。

MMR 基因主要包括 MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2。其中MLH1與PMS2蛋白質形成異源二聚體，MSH2與MSH6蛋白質形成異源二聚體，MLH1和MSH2蛋白質是二聚體的主導蛋白質。本研究發現，206例結腸癌病人中，右半結腸癌MMR蛋白質表達缺失率為13.33%，高于左半結腸癌的7.76%。其中MLH1蛋白質缺失率為10.00%，MSH2蛋白缺失率為 3.33%，MSH6 蛋白質缺失率為 3.33%，PMS2蛋白質缺失率為10.00%。本研究MLH1和PMS2的缺失率高于國內文獻報道的4%～6%，可能是海島地區的特殊地域差異所致[19-20]。本研究發現右半結腸癌MMR蛋白質表達缺失更易表現為低分化，但不易出現神經浸潤（P＜0.05）。

綜上所述，MMR 的 MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2蛋白質表達缺失好發于右半結腸癌，且具有一定的病理特征。更大樣本研究的開展，有助于分析MMR蛋白質表達缺失影響結腸腫瘤分化程度及神經浸潤的機制，以及右半結腸癌MMR蛋白質表達缺失的影響。