減重平板訓練對脊髓損傷大鼠神經(jīng)病理性疼痛及脊髓后角谷氨酸脫羧酶-65/67表達的影響

李向哲，丁潔，王慶華，董傳明，王彤，吳勤峰

1.南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院，江蘇蘇州市 215153；2.浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江杭州市 310016；3.南通大學實驗動物中心，江蘇南通市 226001；4.南通大學醫(yī)學院，江蘇南通市 226001；5.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院康復醫(yī)學中心，江蘇南京市210029

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是脊髓損傷后常見的并發(fā)癥之一，可多方面損害患者的身心健康，降低生活質(zhì)量[1-2]。雖然目前的診療技術和治療手段不斷進展，但由于發(fā)病機制的復雜性，NPP 的治療效果仍不盡如人意[3-6]。脊髓損傷后，脊髓內(nèi)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)合成減少可能是導致NPP 的主要原因之一[7]。動物實驗表明[8-9]，坐骨神經(jīng)損傷后，運動訓練可通過增加脊髓后角內(nèi)GABA 合成酶——谷氨酸脫羧酶-65/67 (glutamate decarboxylase-65/67,GAD65/67)的合成以改善NPP。

本研究觀察減重平板訓練對脊髓損傷大鼠機械性痛閾和熱痛閾的影響，以及遠端脊髓內(nèi)GAD-65/67 的表達，探討運動訓練改善脊髓損傷大鼠NPP 的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

成年雌性Sprague-Dawley 大鼠24 只，體質(zhì)量210～230 g，隨機分為假手術組(Sham 組)、脊髓損傷-不運動組(SCI-Sed 組)和脊髓損傷-運動組(SCI-Ex 組)，每組8 只。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫環(huán)境(22±2)℃，濕度50%～60%，自由飲食，自然光照。

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學倫理委員會批準通過(No.2019-792)。

1.2 模型制作

采用Allen 法制作T10不完全性脊髓損傷模型[10-11]。損傷裝置采用NYU脊椎沖擊損傷儀Model I型(美國新澤西州立大學神經(jīng)科學聯(lián)合中心實驗室提供，打擊頭直徑2.5 mm)，損傷劑量為10 g×25 mm。Sham 組僅暴露脊髓。術后膀胱按摩輔助排尿，每天2 次，連續(xù)5～7 d，直至形成自主排尿。

1.3 減重平板訓練

SCI-Ex 組于脊髓損傷后第8 天進行減重平板訓練[10]。每次運動訓練前手法按摩膀胱區(qū)排空尿液。跑臺速度6 m/min，每次訓練20 min，每天2 次，每周5 d，共4周。訓練時根據(jù)大鼠的功能狀態(tài)，減重范圍設為20%～40%，隨大鼠后肢運動恢復逐漸減小減重程度。

1.4 疼痛評估

1.4.1機械性痛閾

采用Chaplan 等[12]改良的評估法。室溫、安靜環(huán)境中，先將大鼠放置于透明隔籠中適應15 min。隨后將一系列von Frey 細絲(0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g 和15.0 g)從2.0 g 力度開始垂直刺激大鼠后肢腳掌中部皮膚，每次刺激持續(xù)6～8 s，依大鼠的反應依次進行評估(up-down 法[13])，大鼠出現(xiàn)縮足或舔足反應記為陽性(×)，無反應記為陰性(○)，每只大鼠評估時間應小于1 min。以von Frey單絲刺激強度小于4 g 時考慮NPP 的存在[14]。評估時間點：脊髓損傷術前，脊髓損傷后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d。

1.4.2熱痛閾

使用熱刺激痛覺測試儀進行熱痛閾評估。參照Hargreaves[15]提供的評估方法進行。評估前將大鼠置于樹脂玻璃評估籠中適應15 min，每只大鼠評估3次，取縮足反應平均值作為每只大鼠的熱痛閾，每次評估間隔10 min，熱刺激強度設定為20%，最長刺激時間20 s[16]。評估時間點與機械性痛閾評估相同。

1.5 免疫組化染色

痛閾評估結束后，每組取4 只，10%水合氯醛3 ml/kg深度麻醉大鼠，打開胸腔暴露心臟，使用灌注泵生理鹽水250 ml 進行心臟灌注，后使用4%多聚甲醛250 ml 灌注，取出脊髓后，分離L4～L5脊髓節(jié)段，放入4%多聚甲醛4 ℃后固定過夜。酒精梯度脫水，石蠟包埋。石蠟切片機連續(xù)水平橫切，厚5 μm，每隔5 張收1 張，每個樣本收取3 張。脫蠟水化、H2O2孵育、微波修復、封閉液封閉后，滴加兔抗GAD65 多克隆抗體(ab203063，1∶200，美國ABCAM 公司)和鼠抗GAD67 單克隆抗體(MAB5406，1∶1000，德國MINIPORE 公司)，4 ℃過夜孵育。次日PBS 沖洗后，使用生物素標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗在37 ℃恒溫箱中孵育1 h，洗片、DAB 顯色、封片。攝片后使用Image-Pro Plus 6.0進行光密度分析。

1.6 Western blotting

痛閾評估結束后，每組取4 只，10%水合氯醛3 ml/kg 深度麻醉大鼠，斷頭處死，離斷L4～L5脊髓節(jié)段，在液氮中研磨破碎后，加入適量RIPA 裂解液，4 ℃冷庫搖床上消化30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，按照測定濃度加入4×上樣緩沖液使得樣品濃度相同。沸水中變性10 min，分裝后-80 °C 保存?zhèn)溆谩?2% SDSPAGE 膠，上樣蛋白80 μg，20 mA 恒流電泳至目的條帶區(qū)分開，100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜80 min。封閉并加入兔抗GAD65 多克隆抗體(ab203063，1∶1000，美國ABCAM 公司)和鼠抗GAD67 單克隆抗體(MAB5406，1∶5000，德國MINIPORE 公司)和鼠抗GAPDH 單克隆抗體(ab181602，1∶5000，美國ABCAM 公司)，4 ℃孵育過夜。次日用山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜。ECL 法顯影，攝片后使用Image J軟件進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示。機械痛閾和熱痛閾數(shù)據(jù)建立一般線性模型，進行重復測量方差分析，后采用Tukey's POST hoc 對3 組大鼠同一時間點數(shù)值進行兩兩比較。免疫組化和Western blotting 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，若單因素方差分析有統(tǒng)計學差異，再使用POST hoc進行兩兩分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 痛閾

脊髓損傷后各時間點，三組機械性痛閾和熱痛閾的時間、分組和交互效應均顯著(P＜0.001)。脊髓損傷后各時間點，SCI-Ex 組和SCI-Sed 組機械性痛閾和熱痛閾均顯著低于Sham 組(P＜0.001)。脊髓損傷后21 d、28 d 和35 d，SCI-Ex 組的機械性痛閾和熱痛閾均明顯高于SCI-Sed 組(P＜0.01)。脊髓損傷后7 d 和14 d，SCI-Sed 組和SCI-Ex 組機械性痛閾和熱痛閾均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1、表2。

2.2 Western blotting

三組間損傷遠端脊髓內(nèi)GAD-65 和GAD-67 表達量均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。與Sham 組相比，SCI-Sed組和SCI-Ex組的GAD-65和GAD-67表達量減少(P＜0.05)。與SCI-Sed 組比較，SCI-Ex 組GAD-65 和GAD-67 表達量升高(P＜0.05)。見 圖1、表3。

表1 各組von Frey機械性痛閾比較(g)

圖1 各組GAD65和GAD-67的Western blotting相對表達量

2.3 免疫組化染色

在脊髓后角，GAD-65 和GAD-67 主要表達于Lamina I-III。SCI-Sed 組和SCI-Ex 組GAD-65 和GAD-67 相對免疫強度明顯低于Sham 組(P＜0.01)。SCI-Ex組GAD-65 和GAD-67 相對免疫強度顯著高于SCI-Sed組(P＜0.001)。見圖2、表4。

3 討論

脊髓損傷后的NPP 多出現(xiàn)在損傷平面以下，可表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、觸誘發(fā)痛或痛覺過敏等[1-2]。脊髓損傷后NPP 的綜合發(fā)生率約為53%[17]，嚴重影響患者的身心健康[2]。運動訓練是脊髓損傷后常用的功能性康復訓練方案，可通過激活脊髓感覺運動神經(jīng)環(huán)路促進神經(jīng)可塑性和神經(jīng)功能恢復[10,16,18]，調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元的興奮性，減輕脊髓損傷后痙攣和NPP[16,19-20]。但運動訓練對脊髓損傷后脊髓后角內(nèi)的GABA 合成的影響卻少見報道。

GABA 是脊髓內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，由其限速酶GAD-65/67 合成[21]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GAD-65 主要表達于軸突終末，而GAD-67 主要表達于抑制性神經(jīng)元胞體和神經(jīng)終末[21-22]。在大鼠和狗的脊髓內(nèi)，GAD-65 和GAD-67 廣泛表達于脊髓灰質(zhì)，尤其是點狀分布于腰髓Lamina I-III[21,23]，與本研究免疫組化結果一致。當GABA 與GABAA受體通道蛋白結合后，可引起突觸后神經(jīng)元的Cl-內(nèi)流和超極化膜電位，發(fā)揮突觸后抑制作用，使神經(jīng)元的興奮性降低[7]。而激活GABAB受體蛋白可通過減少Ca2+內(nèi)流而發(fā)揮突觸前抑制作用，使初級傳入神經(jīng)纖維膜電位超極化，抑制神經(jīng)末梢的遞質(zhì)釋放[7]。

本研究結果顯示，脊髓損傷可降低大鼠后肢的痛閾，并減少GAD-65/67 的合成，與Meisner 等[23]和Gwak等[7]的研究一致。可能由于在脊髓損傷后，大鼠脊髓后角GABA 能神經(jīng)元丟失或者是缺乏初級出入纖維的刺激所致[7]。運動訓練可明顯改善T10不完全性脊髓損傷大鼠的痛覺過敏，并增加脊髓內(nèi)GAD-65 和GAD-67的合成。

表2 各組熱痛閾比較(s)

表3 各組GAD65和GAD-67 Western blotting相對表達量

圖2 各組GAD-65和GAD-67表達(免疫組化染色，bar=100 μm)

表4 各組脊髓后角GAD-65和GAD-67相對免疫強度比較

坐骨神經(jīng)損傷后，運動訓練可通過增加脊髓后角GAD-65 和GAD-67 合成，調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元興奮性，減輕NPP程度[8-9]。此外，早期運動訓練還可通過減少脊髓后角降鈣素基因相關肽[24]，增加神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子[25]和鉀-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白-2(potassium chloride cotransporter 2,KCC2)表達[16]，改善脊髓損傷后NPP。但是也有研究發(fā)現(xiàn)[26]，早期運動訓練可通過TrkB 信號通路，增加脊髓后角神經(jīng)元興奮性，促進脊髓損傷后NPP的發(fā)生，可能是采用的運動方式不同所致：后者采用的是機械臂輔助下踏步訓練，而減輕NPP的運動訓練多采用主動運動[27]。

Takeoka 等[28]認為，運動訓練可通過肌梭感覺傳入途徑改善脊髓損傷后的運動功能恢復和神經(jīng)功能重組。Li 等[29]發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生后阻斷脊髓感覺傳入，可明顯減弱脊髓后角GABA 能神經(jīng)元的可塑性，并可能促進NPP的發(fā)生。由此可見，感覺信息的傳入可能對脊髓后角神經(jīng)網(wǎng)絡的功能及重塑具有重要的調(diào)節(jié)作用。運動訓練是否能夠通過影響感覺傳入而改善脊髓損傷后NPP，尚需進一步研究證實。

綜上所述，運動訓練可增加不完全性脊髓損傷大鼠損傷遠端脊髓后角GAD-65/67 的合成，并增加大鼠后肢的機械性痛閾和熱痛閾。但運動訓練通過何種途徑和機制增加GAD-65/67 的表達并改善脊髓損傷后的NPP，尚需進一步研究證實。