供腎零點穿刺組織Klotho蛋白表達與病理結果相關性分析

高云龍，馬健波，張睿，武倫，魏澗，高嘉良，茍志敏，劉一魁

(1.錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生培養基地；2.湖北醫藥學院附屬國藥東風總醫院，湖北 十堰 442000)

腎移植是治療終末期腎臟病最有效的治療手段，也是改善患者生活質量最好的方法。目前由于供體腎臟資源的緊缺，為了供腎與患者更好的匹配，減少排斥反應，延長腎臟使用年限，供體腎臟需要穿刺活檢對其質量進行評估。最近文獻報道Klotho蛋白的異常表達與慢性腎臟病[1-3]、急性腎損傷[4]以及缺血在灌注損傷[5-6]有關。Klotho蛋白是由klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，主要在腎小管上皮細胞中表達，相關研究也證實了Klotho蛋白確實與腎上皮細胞衰老有關[7]，并且發現Klotho蛋白有部分腎臟的功能，如調節1，25(OH)2D3、磷酸鹽[8-9]。然而關于Klotho蛋白在移植腎臟中的研究較少。因此，我們研究Klotho蛋白在供腎零點穿刺組織中的作用，旨在探討Klotho蛋白表達情況與供腎零點穿刺病理結果之間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2019年1月至2020年8月期間，我院DCD供腎零點穿刺活檢的石蠟標本及病理報告，共42例(左右腎臟)，其中未在本院行手術9例，蠟塊標本組織在切片時未見組織1例，其余32例，其中男20例，女12例，平均(56.44±6.90)歲。本研究得到醫院倫理委員會批準(LW-2021-002)。

1.2 入選標準

(1)符合器官捐贈標準；(2)術后受者未發生超級性排斥反應及急性排斥反應；(3)無移植腎功能延遲恢復。

1.3 排除標準

(1)供者有明顯的心、肝功能不全；(2)供者病例資料不全者；(3)合并傳染性疾病者。

1.4 分組

根據術前病理科對供腎零點穿刺組織病理結果Remuzzi分級評分，將32例按照總評分的平均值分為高分組(8.13±1.50)和低分組(3.81±1.11)。

1.5 檢測指標

檢測32例供腎零點穿刺組織不同Remuzzi病理分級評分石蠟切片中Klotho蛋白表達情況。

1.6 檢測方法(免疫組織化學手工染色法)

制片：將收集的石蠟放入冰箱中冷凍片刻，取出后進行切片處理，厚度約為4 μm，70 ℃烤片2 h。

脫蠟：將玻片分2次浸泡在二甲苯溶液中(5分鐘/次)，再浸泡在無水乙醇中5 min，然后依次用無水乙醇、95%、75%濃度的酒精快速洗滌，清水沖洗2～3次后吹干。

水化：將載玻片置于搖擺床用PBS液洗3次(3分鐘/次)。

抗原修復：采用高壓鍋加熱檸檬酸溶液，其操作步驟為：將玻片置于其中，開火待煮沸后計時150 s后，關火冷卻15 min，再將玻片置于PBS溶液中(方法同前)。

封閉：為封閉內源性過氧化物酶及蛋白質，將玻片置于3%過氧化氫溶液中浸泡10 min后，繼續用PBS液洗片。

滴加一抗(40 μL，Anti-Klotho抗體，abcam，美國)：根據組織大小滴加適量稀釋比為1∶300的一抗，并恒溫維持在4 ℃孵育過夜；復溫1 h后PBS溶液洗3次(方法同前)。

滴定二抗(50 μL，由武漢安捷特生物技術有限公司進口分裝，武漢市洪山區街道口京韻花園B-2601)檢測試劑：取適量稀釋比為1∶300的二抗滴于玻片，輕輕晃動后，孵育30 min，再次洗片3次。

DAB顯色(DAB顯色試劑盒，3 mL，北京中杉生物技術有限公司)：配制DAB顯色工作液(濃縮DAB溶液50 μm與DAB底物液1000 μm)必須即配即用，顯色8 min。

生態學是一門綜合性、實踐性很強的學科。室內實驗與野外調查相結合是生態學教學中一項十分重要的教學活動，是檢驗理論知識掌握得牢固與否的主要手段。

脫水：將膠片分別在濃度為75%的酒精、95%的酒精、無水乙醇中快速洗滌，然后依次在無水乙醇和二甲苯中浸泡5 min，換二甲苯再次浸泡5 min后，將膠片吹干、封片、閱片。

1.7 研究方法

供腎零點穿刺病理結果根據Remuzzi病理分級評分，據腎小球硬化比例、腎間質纖維化、腎小管萎縮、腎間質炎癥、小動脈內膜纖維化增厚、動脈透明樣變、腎小球內微血栓、腎小管損傷、壞死病理學表現，若無上述情況計為0分；輕度1分；中度2分；重度3分[10]，評分結果見表1，HE染色病理結果見圖1。腎臟各自的評分據32例總評分的平均值分為兩組，每組各16例；將收集到的32例石蠟組織制備的標本玻片由病理科資深醫生隨機選取3個清晰視眼采圖，利用Fiji-ImageJ軟件計算采集圖片的陽性面積所占百分比，取其平均值進行分析計算，并使用Graphpad Prism 8軟件完成箱線圖，分析兩組之間Klotho蛋白表達有無統計學差異。

表1 供腎活檢組織病理學表現評分表

Aa供腎零點穿刺病理結果未見腎小球硬化，未見腎小球系膜細胞及基質增生，血管內未見管壁玻璃樣變及內膜增厚，間質未見纖維組織增生，可見個別炎癥細胞浸潤，與b來源于同一腎臟組織。a、b、c為HE 100×，d為HE 200×

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 Remuzzi病理分級評分分組結果

根據供腎零點穿刺病理結果病理學表現評分按總的平均值分為兩組，每組16例，總平均值為5.97。高分組(8.13±1.50)，其中男7例，女9例；低分組(3.81±1.11)，其中男13例，女3例。

2.2 Klotho蛋白在組織中的表達情況

按照Remuzzi分級評分高低分兩組，檢測Klotho蛋白表達情況，分析兩組之間Klotho蛋白表達差異有無統計學意義。我們的研究結果如下：Remuzzi分級評分高分組(21.61%±8.24%)，Remuzzi分級評分低分組(49.90%±9.71%)，兩組之間Klotho蛋白表達也有統計學差異(F=0.36，P<0.001)，見圖2～4。

左100×，右400×

左：100×，右：400×

圖4 Remuzzi病理評分兩組之間Klotho蛋白表達情況

2.3 組織Klotho蛋白表達與年齡相關關系

統計32例腎臟組織Klotho蛋白表達平均水平(35.76%±16.88%)，供腎零點穿刺組織中Klotho蛋白表達與供腎年齡沒有發現線性相關關系，見圖5。

2.4 組織Klotho蛋白表達與Remuzzi病理結果評分相關關系

發現供腎零點穿刺組織中Klotho蛋白表達(%)與其對應病理結果高度相關，有統計學意義(r=-0.834，P<0.001)，見圖6。

r=-0.033，P<0.859

3 討 論

本報告是對32例我院DCD供腎零點穿刺組織病理Remuzzi病理結果評分與其對應組織中Klotho蛋白表達情況之間關系的研究。其人群特點：其中男20例，女12例，平均(56.44±6.90)歲，獲取前的評估均符合腎臟器官捐贈標準，供腎者既往史沒有高血壓、糖尿病、腎炎及嚴重傳染病史，在移植術后均未出現急性排斥反應及移植腎失功。

腎移植手術能夠給尿毒癥患者帶來最大的受益，但對供腎質量的評估，目前仍缺乏一個統一的標準，零點穿刺病理檢查是評估供腎質量的一種重要方法，其優勢主要體現在供腎組織形態學改變上。近期大量研究發現Klotho在基因及蛋白表達分子層面對腎臟有一定保護作用[11-12]，這可能與Klotho蛋白能夠降低炎癥因子、抑制氧化應激介質的產生[13-14]、抑制纖維化[15]有關。

我們通過對供腎零點穿刺組織HE染色，Remuzzi病理結果評分進行分組，并對相對應的各組中零點穿刺組織進行免疫組織化學染色測定石蠟標本中Klotho蛋白的表達。在手術前病理科對供腎零點穿刺病理結果根據Remuzzi分級評分分為兩組，發現兩組分別對應Klotho蛋白陽性表達面積百分比之間的差異也有統計學意義(P<0.001)見圖4；與此同時我們進一步通過線性回歸方法分析了32例Remuzzi分級評分與對應供腎零點穿刺組織中Klotho蛋白表達陽性面積百分比之間的關系，發現供腎零點穿刺組織中Klotho蛋白的表達與其Remuzzi分級評分之間有高度相關性(r=-0.834，P<0.001)，圖1與圖2來源于同一組織。之前有研究報道[16]顯示Klotho蛋白表達與年齡有一定的關系，因此我們也分析了供腎零點穿刺組織中Klotho蛋白的表達與年齡之間的關系，發現供腎零點穿刺組織中Klotho蛋白的表達與年齡之間沒有發現相關性(r=-0.033，P=0.859)，這一結果與上述報道結果不一致，可能源于個體之間的差異或者標本不同、樣本量有關。

觀察免疫組織化學染色病理結果發現Klotho蛋白表達主要分布于細胞膜及胞漿內，尤其是多見于Remuzzi分級評分低分組，然而我們知道Klotho蛋白表達主要表達在細胞膜上，因此我們猜測胞漿的陽性表達與細胞膜分泌有關，這一結果在之前報道已經得到證實[17]，他們研究發現Klotho蛋白有自分泌與旁分泌功能。這一觀點與我們研究結果是一致的，認為胞漿內可見褐色染色來源于細胞膜的表達。

綜上所述，Klotho蛋白在供腎零點穿刺組織不同病理結果中的表達有醫學統計學差異。目前零點穿刺病理檢查是評估供腎質量的一種重要手段，能夠客觀地對組織形態改變進行評價，而腎臟組織Klotho蛋白研究主要在分子水平。因此，兩者結合可以對腎臟組織形態學及分子水平綜合評價，對供腎質量更全面地了解，能更準確地評估供腎功能水平。當然由于我院腎臟移植手術數量有限、納入本研究的病例樣本例數相對較少，供腎零點穿刺組織較小，其結論仍然需要多中心聯合、擴大樣本量驗證，并且對供受者血液中Klotho蛋白的檢測有待進一步研究，以便為術后腎功能檢測提供一定理論依據，為臨床醫生提供腎移植術后潛在治療靶點。