異土木香內酯對人舌鱗癌Tca8113細胞的增殖、遷移和侵襲的影響

王明波

(錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000)

舌鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，發病率約占口腔癌 1/3～1/2，臨床治療主要以手術治療為主，以放療及化療為輔[1-3]。由于舌的淋巴管及血運豐富，并且舌的活動頻繁，舌癌極易發生區域淋巴結及遠處轉移，手術不易完全清除。化療可在一定程度上控制腫瘤的負荷量，但舌癌對化療及放療敏感性差，導致化療效果不佳，從而引起腫瘤的復發及轉移[4-5]。異土木香內酯來源于菊科旋覆花屬植物土木香的干燥根，屬多年生草本植物。異土木香內酯(isoalantolactone，IAL)是從土木香中提取的半萜烯內酯類小分子化合物。研究表明，異土木香內酯能抗真菌和細菌的作用，能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌agr二元調控系統，依賴性地降低金黃色葡萄球菌SEA和SEB的表達[6]。最近研究表明，異土木香內酯也有抗腫瘤的作用，IAL可抑制膀胱癌細胞株T24細胞增殖，促進細胞凋亡[7]。IAL通過上調p38-MAPK來抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲[8]，IAL通過激活p53從而使人肺鱗狀癌細胞凋亡[9]。本實驗通過研究異土木香內酯對Tca8113細胞增殖、凋亡的影響及其機制，來探討異土木香內酯對舌癌的治療可能性。

1 實驗材料

舌鱗癌細胞株Tca8113(錦州醫科大學附屬第一醫院外科重點實驗室提供)，1640培養基(SoLarbio)，DMEM培養基(soLarbio)，胎牛血清(BIOIND)，胰酶(servicebio)，DMSO(SoLarbio)，CCK-8溶液(瑟歐生物)，EDU試劑盒(銳博生物)，transweLL小室(NEST)，TUNEL凋亡檢測試劑盒(塞維爾生物)，96孔板(NEST)，離心管(NEST)。倒置顯微(UOPDSY5000X)，酶標儀(BECKman couLter AD340)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養

舌癌細胞Tca8113來源于錦州醫科大學，在-80 ℃冰箱取出復蘇后，在 37 ℃、5%CO2，進行培養。取對數生長期細胞，用PBS洗滌1～2遍，并用2 mL胰蛋白酶加入培養皿中進行消化，將消化好的混懸液1000 rpm條件下離心5 min；按照DMSO∶胎牛血清=1∶9的比例配置細胞凍存液；棄去上清，在離心管中加入凍存液，重懸細胞；通過細胞計數調整懸液濃度，吸取1～1.5 mL懸液，移至凍存管中，做好標記；將凍存管依次放入4 ℃、-20 ℃冰箱各30 min，再放入液氮內的凍存盒里凍存。

2.2 異土木香內酯作用于Tca8113細胞的IC50值

將用DMSO稀釋成10、20、40、80、120、160 μM的溶液待用，實驗組為不同濃度的異土木香內酯溶液，對照組為DMSO稀釋液，將預先制備好的細胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養板，(每組6個復孔)，然后將培養板在培養箱預培養24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，從培養箱里取出培養板，每孔加入10 μL不同濃度異土木香內酯溶液和DMSO稀釋液繼續培養，48 h后，采用CCK8試劑盒進行檢測，用酶標儀測定在450 nm處的每個孔的吸光值，記錄測量值，測算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[1-(實驗組OD值-空白OD值)/(對照組OD值-空白OD值)]×100 %。

2.3 應用CCK8法檢測異土木香內酯對TCA8113細胞增殖能力的影響

實驗分為對照組合實驗組，實驗組為20 μM的異土木香內酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。將預先制備好的細胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養板，(每組不少于5個復孔)，然后將培養板在培養箱預培養24 h(37 ℃，5% CO2)。24 h后，從培養箱里取出培養板，每孔加入 10 μL 待測物質后放回培養箱持續孵育。分別在0、12、24、36 h，從培養箱里取出培養板，再向每孔加入10 μL CCK8工作液。再次放回培養箱孵育1～2 h，后拿出培養板用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。并記錄實驗數據。

2.4 EDU法檢測異土木香內酯對Tca8113細胞增值力的影響

將預先制備好的細胞懸液按每孔100 μL加入96孔培養板，分為兩組，每組2個復孔，實驗組為20 μM的異土木香內酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。首先將培養板在培養箱，37 ℃，5% CO2，培養至正常生長狀態。然后配制適量的EDU試劑，并進標記，經固定染色后，在熒光顯微鏡下，觀察細胞顏色并拍照，紫外光下，細胞核全染為藍色，綠光下增殖細胞核染為紅色。

2.5 細胞劃痕實驗檢測異土木香內酯對Tca8113細胞遷移能力影響實驗

實驗仍分為兩組，每組2個重復，實驗組為20 μM的異土木香內酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。將Tca8113細胞接種于6孔板中，過夜培養，鋪滿底部。第2天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，用PBS洗細胞3次，去處劃下的細胞，加入無血清培養基。放入37 ℃ 5%CO2培養箱培養。按0、6、12、24 h，分別對實驗組和對照組進行拍照，并記錄劃痕位置及寬度。用Photoshop軟件計算劃痕前后細胞之間空白處面積差(單位：像素)，取平均值，計算遷移率。遷移率=(劃痕0 h空白處面積-劃痕后 24 h空白處面積)/劃痕0 h空白處面積。

2.6 Transwell 侵襲實驗檢測異土木香內酯對Tca8113細胞侵襲能力影響實驗

實驗仍分為兩組，每組2個重復，實驗組為20 μM的異土木香內酯DMSO稀釋溶液，對照為DMSO稀釋液。在培養瓶中加入胰酶進行消化，調整細胞至合適密度觀察計數。24孔板中，在下室加入400 μL完全培養基，上室加入不含血清的細胞懸液200 μL，然后置于培養箱中培養，培養24 h后，用多聚甲醛固定25 min，生理鹽水清洗3次，加入結晶紫進行染色40 min，在顯微鏡下比較兩者之間的差異性，記錄測量值，利用GraphPad軟件輔助分析實驗結果。

2.7 Tunel實驗異土木香內酯對Tca8113細胞凋亡的影響

實驗仍分為兩組，每組2個重復，實驗組為20 μM的異土木香內酯DMSO稀釋溶液，對照為 DMSO稀釋液。在24孔板上培養貼壁細胞。按照TμNEL凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測。處理好的樣本立即在熒光顯微鏡下分析拍照，載玻片注意避光。DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成藍色，只在凋亡的細胞核中才有CF640-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

2.8 Western Blot檢測相關蛋白表達的影響

準備4組對數生長期的Tca8113細胞，每瓶細胞數基本保持一致，實驗設置實驗組、對照組和空白對照組。實驗組：配制10 μM和20 μM的異土木香內酯溶液，將配置好的異土木香內酯溶液分別接種Tca8113細胞；同時以 0.5% DMSO 處理組作為對照濃度；空白對照組為不做任何處理的Tca8113細胞。分別提取總蛋白，采用BCA試劑盒進行蛋白定量，經采用SDS-PAGE電泳、轉印、染色照相后。分別檢測舌癌細胞Tca8113的GAPDH內參蛋白，Caspase3、Bcl-2蛋白的表達水平，來檢測異土木香內酯對舌癌細胞的作用。

3 實驗結果

3.1 異土木香內酯作用于Tca8113細胞的IC50值

經檢測，對照組、10、20、40、80、120、160 μM組的平均吸光值分別為0.451、0.285、0.224、0.235、0.221、0.235和0.274。通過與對照組比較計算，得出即 IC50值為20 μM。在后續實驗中，異土木香內酯的作用濃度均為 20 μM，見圖1。

圖1 不同濃度異土木香內酯作用于Tca8113細胞的OD值

3.2 異土木香內酯對Tca8113細胞活力影響實驗結果

通過CCK-8法檢測20 μM異土木香內酯在36 h內對Tca8113細胞活性的影響，經檢測，隨著時間增加，實驗組的Tca8113細胞活性逐漸降低，見圖2。

*P<0.05

3.3 異土木香內酯對 Tca8113 細胞克隆形成能力影響實驗

實驗結果顯示，在7 d內，與對照組相比，實驗組的克隆數明顯減少。20 μM異土木香內酯對Tca8113細胞增殖能力具有明顯的抑制作用，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

***P<0.001

3.4 異土木香內酯對Tca8113細胞增殖力影響實驗

EDU實驗檢測證明：實驗組與對照組相比增殖能力明顯減弱，以P<0.01為差異有統計學意義。以上結果提示，20 μM異土木香內酯對Tca8113細胞增殖能力具有抑制作用，見圖4。

**P<0.01

3.5 異土木香內酯對Tca8113 細胞遷移能力影響實驗結果

劃痕實驗結果顯示，實驗組與對照組相比，Tca8113細胞爬行距離變小，以P<0.01為差異有統計學意義，表明細胞遷移能力明顯減小，見圖5，遷移率見表1。說明20 μM的異土木香內酯對Tca8113細胞遷移能力具有抑制作用。

圖5 實驗組與對照組劃痕實驗0 h與24 h比較

表1 實驗組與對照組細胞遷移率比較

**P<0.01

3.6 異土木香內酯對Tca8113細胞侵襲能力影響實驗結果

Transwell實驗表明，實驗組與對照組相比，侵襲能力明顯減弱，以P<0.01為差異具有統計學意義。如圖7所示，表明異土木香內酯對Tca8113細胞侵襲能力具有抑制作用。

3.7 異土木香內酯對Tca8113細胞凋亡影響實驗結果

Tunel實驗結果顯示，實驗組與對照組相比，Tca8113細胞凋亡明顯增多，以P<0.01為差異有統計學意義。結果表明20 μM異土木香內酯對Tca8113細胞凋亡具有促進作用，見圖8。

**P<0.01

**P<0.01

3.8 Western Blot

結果表明，不同處理組的內參蛋白GAPDH的表達水平無差異，表明其幾乎不受其他因素影響，可以作為內參得到每個樣品的相對含量。與對照組相比，異土木香內酯組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而促凋亡蛋白Caspase-3活性水平均顯著增加，與濃度呈正相關，以P<0.01為差異有統計學意義，見圖9。

圖9 Western Blot實驗結果圖

近年來，舌癌的發生率有上升的趨勢，且其惡性程度較高，生長快，浸潤性強。舌癌晚期波及口底、下頌骨，向后侵及腭舌弓及扁桃體；侵及舌根部或伴繼發感染時發生劇烈疼痛。對于惡性舌癌的治療以手術為主聯合其他治療方法，根據患者的具體情況來實施治療方案。一般來說，手術切除原發病灶，手術解決的是局部病灶及手術可涉及范圍內的病灶，但對于已有遠處轉移病例的治療或在預防復發方面是無能為力的，這時依靠化學藥物治療或生物治療具有一定的療效。另外，利用中藥治療配合手術治療、放射治療和化學治療可起到很好的治療效果，因為中藥治療能提高免疫功能，從而起到提高和鞏固療效的作用。已有研究經證實，有數百種中藥材具有抑制腫瘤癌細胞生長的作用，諸如百安、參陽、苗藍、黃寄素、清瘤亮喉等在體外實驗研究、治療或輔助治療口腔鱗癌中，均顯示出了明顯的殺腫瘤作用[10-13]。本研究對異土木香內酯對舌癌Tca8113細胞的影響及其可能的產生調節作用的機制進行了探討，本研究中采用CCK-8法測出異土木香內酯對Tca8113細胞 IC50值為20 μM，且在36 h內，異土木香內酯對Tca8113細胞活性具有明顯的抑制作用。已有研究表明異土木香內酯對膀胱癌T24細胞的IC50值為22.45 μmol/L[14]。通過EDU實驗發現，20 μM的異土木香內酯可以抑制舌癌Tca8113細胞增殖，這些實驗結果說明異土木香內酯可能在治療舌癌中具有潛在的可能性。癌細胞遷移和侵襲是發生癌轉移的基礎[15]，本實驗中，細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果表明0 μM的異土木香內酯可以有效的抑制舌癌Tca8113細胞的遷移和侵襲。Tunnel實驗證明其可以誘導Tca8113細胞凋亡。其可能原因是其可以調節細胞的代謝通路。有文獻報道，異土木香內酯可以通過上調p38-MAPK誘導胰腺癌PANC-1細胞凋亡[16-18]和抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲[19]，激活p53來誘導人肺鱗狀癌細胞凋亡，還有文獻報道其通過增加ROS誘導前列腺癌PC3細胞凋亡[20-22]。

綜上所述，異土木香內酯對舌癌細胞具有抑制作用，但是其作用機制還需要進步研究。發現其在舌癌臨床應用前景及價值。

4 討 論

本研究對異土木香內酯對舌癌Tca8113細胞的影響及其可能的產生調節作用的機制進行了探討。研究中通過CCK8實驗，對異土木香內酯的體外藥效做了初步研究，以舌癌Tca8113 細胞為研究對象，研究異土木香內酯對舌癌Tca8113細胞的抑制作用，CCK8結果顯示，在孵育時間為24 h內，異土木香內酯對舌癌Tca8113細胞的IC50值為20 μM，在0～20 μM 濃度范圍，隨著濃度增加，抑制作用增強，但是濃度范圍為20～80 μM，抑制作用增強效果不明顯。克隆形成實驗和EDU實驗進一步驗證了20 μM 異土木香內酯可以抑制舌癌Tca8113細胞增殖，同時抑制細胞克隆形成。細胞劃痕實驗和Transwell實驗結果表明20 μM的異土木香內酯可以有效的抑制舌癌Tca8113細胞的遷移和侵襲。但具體機制不明確，因此需要進一步的實驗研究。本研究中通過Tunnel實驗和Western Blot實驗證明，異土木香內酯可以誘導Tca8113 細胞凋亡。可能原因是其可以調節細胞的代謝通路。

綜上所述，異土木香內酯能抑制舌鱗癌 Tca8113細胞的增殖、遷移侵襲并促進Tca8113細胞凋亡，并呈一定濃度時間依賴性。但具體機制不明確，因此需要進一步的實驗研究。