Poloxamer188復合米托蒽醌聚D，L-乳酸-co-乙醇酸電紡纖維的表征

王瑛穎，董欣，劉陽，黃佳娜，王浩

(1.錦州醫科大學藥學院，遼寧 錦州 121000；2.山東省醫用高分子材料重點實驗室，山東省藥學科學院，山東 濟南 370102)

電紡纖維作為藥物釋放載體應用近20年了，采用脂肪族聚酯作為成纖維材料被認為是比較理想的選擇，但是脂肪族聚酯的有機溶液表面張力較大，較難形成形態理想的纖維。所以，人們嘗試將表面活性劑共溶解在脂肪族聚酯的有機溶液中以降低體系的表面張力，以期順利靜電紡絲并得到形態較理想的復合纖維[1-2]。這其中，非離子型表面活性劑由于其低毒性、良好的共溶解性、對水不溶藥物較高的增溶作用等，是一種較理想的選擇[3]。被采用的非離子型表面活性劑已經有很多，這其中又以Poloxamer188最為理想，并得到了較多的研究。原因主要有4點：(1)Poloxamer188低溶血性、低毒性、可腎排泄，生物學性質良好，是現有的屈指可數的可以靜脈注射的表面活性劑；(2)電紡纖維比表面積大，在制備過程中會較多的接觸氣體環境，Poloxamer188分子中主要為碳-碳單鍵和醚健，化學性質穩定，尤其是對空氣中的氧氣、二氧化碳、水蒸氣穩定；(3)Poloxamer188對很多水不溶化合物的增溶，且增溶量很高；(4)Poloxamer188相對廉價、易得[4-5]。

現有的關于Poloxamer188復合脂肪族聚酯電紡纖維中的成纖維材料主要集中在聚L-乳酸，對于聚D-乳酸-co-L-乳酸共聚物、聚乳酸-co-乙醇酸共聚物、聚ε-己內酯等研究較少。本論文采用聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(poly D，L-lactic acid-co-glycolic acid，PLGA)作為纖維形成的基質材料，Poloxamer188為復合表面活性劑，將模型藥物米托蒽醌(Mitoxantrone)通過與前兩者共溶液-靜電紡絲的方法載入該纖維中?？疾焖美w維的形態、載藥、釋藥行為。將米托蒽醌載入電紡纖維亦有一定的藥劑學意義。該藥是治療乳腺癌的首選藥物，對某些其他腫瘤也有較好的療效。局部給藥劑型：如水凝膠、大粒徑脂質體、電紡纖維等，可能會提高其治療指數[6-8]。作為植入型藥物新劑型進行研究和使用也一直是通過靜電紡絲制備所得微納米級纖維膜、氈、支架等材料的主要應用方向[9-10]。

1 材料與方法

高壓靜電發生器(東文高壓電源廠，中國，天津)；臺式掃描電子顯微鏡(TM3000，Hitachi公司，日本)；高效液相色譜儀(ELITE LaChrom，Shimadzu公司，日本)；PHS-2F精密酸度計(精科儀器，中國，上海)。

米托蒽醌原料藥(含量98.9%，美侖生物技術有限公司，中國，大連)；n-十二醇引發開環聚合并單封端的聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(PLGA，由本課題組合成[11]，第1種是摩爾比為乳酸∶乙醇酸=70∶30，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50，Mw=15.6萬，多分散系數PDI=1.36；第2種是摩爾比為乳酸∶乙醇酸=50∶50，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50，Mw=14.9萬，多分散系數PDI=1.41)；Poloxamer188(德國Basf原產進口分裝，美侖生物技術有限公司，中國，大連)；二氯甲烷(分析純，天力化學試劑公司，中國，天津)；乙酸(分析純，天力化學試劑公司，中國，天津)；乙腈(色譜純，光復精細化工，中國，天津)；去離子水(娃哈哈集團，中國，杭州)。

2 方 法

2.1 靜電紡絲與材料表征

首先，配制材料全部溶解、體系均一無分層、3日內穩定的紡絲溶液以待靜電紡絲。其中PLGA的量每組均設為1 g，不同樣品中Poloxamer188的量不同，以考察Poloxamer188復合量對纖維形態及藥物釋放的影響。實驗采用均相溶液紡絲法，要求各物質均要溶解在溶劑中。為了使得米托蒽醌能夠完全溶解在PLGA-Poloxamer188-二氯甲烷共溶液中，本實驗在該體系中又加入了0.5 mL乙酸。本文試驗了兩種PLGA，第1種是摩爾比為乳酸∶乙醇酸=70∶30的；第2種是摩爾比=乳酸∶乙醇酸為50∶50的，發現在含有米托蒽醌、Poloxamer188和PLGA 3種固體物質的二氯甲烷-乙酸的混合溶劑體系中，采用第1種PLGA時能夠形成所有固態物質完全溶解、無沉淀的共溶液體系，且該體系呈深藍色；但是采用第2種PLGA時，體系中的PLGA不能完全溶解。所以，本文提及的實驗結果均為乙醇酸(摩爾比)為70∶30的PLGA。為了考察纖維中米托蒽醌的載量和Poloxamer188的復合量對纖維形態和藥物釋放經時百分率的影響，設置了10%、20%、30% 3種Poloxamer188復合量和15%、30%、45% 3種米托蒽醌載量。所得纖維的命名見表1。

表1 各電紡纖維中Poloxamer188和米托蒽醌對聚D，L-乳酸-co-乙醇酸的質量比率(%)

各種材料加入溶劑后磁力攪拌72 h，得到深藍色、透明且無不溶物的粘稠溶液。紡絲裝置參考文獻搭建完畢后按如下條件靜電紡絲：紡絲電壓為12 000 V，供液速度為(2.0±0.25) mL/h，紡絲距離(針頭與錫箔平面之間的距離)為25 cm，空氣溫度為(20±2)℃，空氣相對濕度為(50±2)%。電壓加載后發現一些溶液從針頭口流出的紡絲液在電場力的作用下能夠順利形成Taylor錐，一些則不能夠。形成的Taylor錐以螺旋軌跡向接收平板運行并沉積。紡絲完畢后，接收平板上形成一張由纖維層積而成約(1.1±0.2)mm厚的無紡纖維薄氈。揭下該氈后，(35±2)℃下真空除溶劑72 h，按一定規格用剪刀切成小片后進行表征、藥物釋放等研究[12]。

外觀上所制得的電紡纖維為深藍色纖維氈，將其剪切成0.5 cm×0.5 cm小片后用導電膠固定在金屬砧上并用金真空蒸鍍，之后用掃描電子顯微鏡進行電紡纖維微觀形貌的觀察。

X-射線衍射分析方法：稱量約1 g的電紡產品均勻鋪于玻璃片的凹槽內并置于廣角X-射線衍射儀室溫下測試，掃描范圍：5°～60°，掃描速率：8o/min。

差示熱分析方法：稱量約25 mg電紡產品，置入合金金屬樣品盒內壓封，置于差示熱分析儀，氮氣流保護下溫度從25 ℃升至400 ℃，升溫速率：5 ℃/min。

2.2 藥物釋放

采用高效液相色譜-紫外分光光度法測定釋放介質中米托蒽醌的含量。色譜條件：色譜柱Elite?C18柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相為乙腈-庚烷磺酸鈉溶液(v/v=33/67)；檢測波長為244 nm；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL。庚烷磺酸鈉溶液的配制為：取4.4 g庚烷磺酸鈉溶于200 mL純水中，加6.4 mL冰醋酸，用水稀釋至730 mL[13]。

將樣品剪切成約5 cm×5 cm正方形條，使得每片的質量約為100 mg，浸入30 mL磷酸緩沖鹽釋放介質中(磷酸緩沖鹽的配制為：取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉15.2 mL，用水稀釋至95 mL后用磷酸調pH為6.4，最終定容至100 mL)。置于恒溫空氣浴搖床中，在37 ℃、100 r/min條件下振搖釋放。在設定的時間點取出全部釋放介質后按照前述方法進行米托蒽醌含量的測定。之后在釋放介質中重新添加30 mL新的釋放介質。繪制絕對釋放量和相對釋放百分率對時間的曲線[14]。

3 結果與討論

3.1 纖維形態

所有所得纖維外觀均為深藍色纖維氈，藍色的原因顯然是藥物本身的顏色所導致的。圖1為電子顯微鏡下觀察所得纖維的微觀形態。發現F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%能順利紡絲并形成纖維，其他情形不能順利紡絲形成纖維。這其中，形態較為理想的纖維是F-10%-30%和F-10%-45%，表現為無珠子結構出現且纖維直徑較為均一。F-10%-15%有很多珠子結構出現，F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%纖維直徑不均一且黏連較為嚴重，有零星珠子結構出現。無論纖維形態理想與否，在纖維表面均無材料分相和結晶析出現象，提示材料的復合與藥物的包裹可能較為理想，但是具體情況和藥物的釋放行為還需要進一步表征。

在本研究中，待紡溶液中含有米托蒽醌、PLGA、Poloxamer188、二氯甲烷、乙酸等5種物質，又由于各種物質之間相互復雜作用，所以該體系是一個十分復雜的體系。實驗中亦考察了其他Poloxamer188復合量和米托蒽醌載量的情形，但是發現當Poloxamer188復合量較高時(>30%)，藥物突釋十分明顯，故本文僅考察10%、20%和30%的Poloxamer188復合量的情形并以此為例探討Poloxamer188復合量對纖維形態及藥物釋放的影響。同時也發現藥物的復合量對待紡液的可紡性和纖維形態亦有明顯影響。另外，當Poloxamer188和米托蒽醌的載量發生變動時，體系會出現不能紡絲、固體物質溶解不完全，顏色過深不能觀察溶解狀態等情況。這些現象的原因暫時未能明晰，有待以后繼續深入研究。

3.2 藥物釋放與材料復合

圖2A為系列樣品中米托蒽醌的絕對釋放量，經過折算得到經時絕對釋放量相對于各樣品載藥量的百分釋放量如圖2B所示?？芍w維中Poloxamer188復合量與米托蒽醌載藥量對藥物本身的釋放行為均有影響，兩者在纖維中載量的升高均會導致米托蒽醌突釋量和平臺期釋放量的升高。當Poloxamer188復合量從10%增加至20%和30%時，載藥量10%的纖維的百分釋放量從30.5%增至49.3%和71.0%。當Poloxamer188復合量從10%增加至20%時，載藥量20%的纖維的百分釋放量從49.3%增至65.3%。當Poloxamer188復合量不變(15%)，米托蒽醌的量從10%增加到20%和30%時，其百分釋放量從30.5%增加至49.3%和71.0%。

F-10%-15%F-10%-30%F-10%-45%

F-10%-15%#F-10%-30%#F-10%-45%#

F-20%-15%F-20%-30%F-30%-15%

A代表絕對釋放量；B代表相對百分釋放量；C代表相對百分釋放量前24 h局部

米托蒽醌載藥量與Poloxamer188復合量對釋放曲線的形狀沒有明顯的影響。所有被考察的電紡產品均由突釋相和平臺相組成，緩釋相比以往相關研究的小很多。所考察樣品的突釋量(15 min時的百分釋放量)均小于30%，但是隨之在12 h之內釋藥量迅速上升，并且緩釋期除了F-10%-45%外均小于12 h，即12 h后幾乎再無明顯的釋放增量(12 h后的釋放量<24 h前的10%)，釋放曲線已經達到平臺相，如圖2(C)所示。在42 d(1008 h)后，各個纖維中仍然有較多未釋放的藥物。

A從下至上分別代表米托蒽醌、 Poloxamer188、PLGA、F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%

由圖3的X-射線衍射圖譜可知，米托蒽醌在5°～30°之間呈現較多的特征峰，Poloxamer188在19.16°和23.32°處有2個明顯的特征峰，PLGA在量程范圍內無特征峰，只有在10°～30°范圍內衍射強度較其他2θ處大，形成一個“饅頭峰”。5種載藥纖維中任何一種載藥纖維的衍射圖譜上均無衍射強度較大即明顯的特征峰，但是F-10%-15%，F-10%-30%和F-20%-15%在“饅頭峰”上有若干衍射強度較小的峰，且在低角度處亦有特征峰出現。但這些峰未能歸屬，可能是材料復合和載藥過程中出現的結晶特征，其可能由纖維中的一種物質引起，亦可能是纖維中幾種物質復合后所導致的現象?？偟膩碚f，靜電紡絲后具有明顯特征峰的米托蒽醌和Poloxamer188的特征峰均無展現，說明兩者在纖維表面分散良好，這是藥物釋放的前提。

A從下至上分別代表米托蒽醌、Poloxamer188、PLGA、F-10%-15%、F-10%-30%、F-10%-45%、F-20%-15%、F-20%-30%、F-30%-15%

圖4為纖維中3種原料和系列載藥電紡纖維樣品的差示熱分析曲線，發現米托蒽醌和 Poloxamer188 均對電紡纖維的熱分析曲線有明顯影響。熱分析曲線展現了米托蒽醌的兩個尖銳的吸熱峰，在76.4 ℃和175.9 ℃；Poloxamer188有一個較寬的放熱峰，谷值在227.9 ℃和274.6 ℃，且該峰較為寬泛，跨度從150 ℃～300 ℃；PLGA原料的分解峰較大，峰值在353.7 ℃。靜電紡絲后，米托蒽醌的峰未明顯出現，說明該藥物較好復合在電紡纖維中，佐證了X-射線衍射的結果。另一方面，載藥電紡纖維的在較高溫度時曲線上呈現較多變化，體現在均有放熱峰的存在，這可能是Poloxamer188的復合引起的。但是放熱峰的大小很不同，對于F-10%-15%、F-10%-30%和 F-10%-45%，其放熱峰相比F-20%-15%、F-20%-15%和F-30%-15%小；F-10%-15%和F-10%-30%的峰谷位均在300 ℃以下，與Poloxamer188原料的峰谷位較為相近。F-30%-15%、F-20%-15%和F-20%-15%的峰谷位在300 ℃～350 ℃之間，遠離Poloxamer188原料的峰谷位。這說明，Poloxamer188復合量的升高導致了復合效應的增大，而復合效應增大有可能導致藥物釋放量的增高，這佐證了藥物釋放量的結果。F-10%-15%、F-10%-30%和 F-10%-45% 3者中，隨著載藥量的增高，峰谷位逐漸向高溫移動，亦說明復合效應的增強，亦會導致藥物釋放量的增高，藥物釋放量的結果同樣解釋了這一點。

一般地，X-射線衍射的結果只能夠說明纖維表面材料復合的狀態，但纖維內部材料復合情況需要差示熱分析等手段進行表征，綜合本實驗中X-射線衍射和差示熱分析的結果可以得知，對于F-10%-15%、F-10%-30%和F-10%-15%，纖維表面有些許小峰提示了表面復合的不完全，且前兩者纖維內部的復合亦不如其他纖維。可見兩種表征結果互為佐證。

根據藥物釋放的結果和X-射線衍射、差示熱分析的表征結果，以及相似研究內容文獻中的信息，可以得出以下3點結論：(1)雖然米托蒽醌在15 min后的釋放量不是很大，但是在12 h內便會達到最大釋放量，12 h內的釋放量可以認為是該系列纖維的突釋量，這提示了相當比例的藥物存在于纖維表面或近纖維表面的部位，但是以形成無定型復合物狀態存在；(2)Poloxamer188復合量的升高、米托蒽醌的載量升高均有助于藥物本身的釋放，可能原因為兩者載量較多時均能夠形成致孔效應，材料間的良好復合是藥物能夠較大量釋放的前提；(3)平臺期后仍然有相當比例的米托蒽醌沒有被釋放及其釋放曲線在較短的時間內即達到平臺期等現象說明有相當部分的米托蒽醌在纖維中與PLGA結合緊密，難以在纖維基質內部移動，這可能是由于米托蒽醌中蒽醌上的羥基和側鏈上的胺基等與PLGA發生氫鍵作用進而緊密結合所導致的[14-16]1-5，這需要進一步的研究。

3 結 論

本實驗采用均相溶液紡絲法制備載有米托蒽醌的Poloxamer188復合PLGA電紡纖維，并在紡絲液中添加乙酸使米托蒽醌充分溶解。發現當米托蒽醌的載量在10%Poloxamer188復合量在30%和45%時能夠得到形態較為理想的纖維。當米托蒽醌的載量在30%Poloxamer188復合量在15%時藥物的百分釋放量最高。本研究提供了聚D，L-乳酸-co-乙醇酸(摩爾比乳酸∶乙醇酸=70∶30，D-乳酸∶L-乳酸=50∶50)電紡纖維中Poloxamer188及米托蒽醌載量對纖維形態及釋藥行為影響的初步信息。