GDF-15對糖尿病小鼠肝損傷保護作用的實驗研究

張泓嬌，王小梅，王雅光，田鶴,穆長征

(1.錦州醫科大學組織學與胚胎學教研室；2.錦州醫科大學附屬第一醫院；3.錦州醫科大學研究生學院，遼寧 錦州 121000)

糖尿病嚴重危害著人們的健康，其中2型糖尿病(type 2 diabete，T2DM)患者居多[1]。肝損傷是糖尿病并發癥之一[2]。T2DM患者由于高血糖癥出現，導致蛋白功能喪失，進而使肝臟氧化損傷。轉氨酶升高是肝臟損傷的判斷指標之一，肝臟中最常見的轉氨酶是丙氨酸轉移酶(alanine transferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)；已糖激酶(hexokinase，HK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是調控糖酵解的酶，糖酵解是維持血糖穩定的重要因素，HK、PK升高會導致血糖升高，血糖升高會使炎癥標志物升高，最終使活性氧(ROS)升高。丙二醛(malondialdehyde，MDA)作為氧化物的代表，可損傷肝細胞膜以及線粒體膜，從而損傷肝細胞。肝細胞損傷后，有大量的細胞因子產生，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素(interleukin，IL)等。

生長分化因子-15[3](growth differentiation factor-15，GDF-15)是一種氧化應激蛋白。在正常狀況下，GDF-15大量表達在胎盤及前列腺等少數的組織。在腫瘤、炎癥、心血管疾病以及外傷等各種應激狀態下，GDF-15會大量表達[4]。目前，有實驗證明它是肝臟損傷的新型標志物，并且通過免疫抑制、抗凋亡、抗炎和促進氧化代謝等方面對肝臟起到保護作用[5]。臨床研究報道血清中GDF-15水平可作為一個有效的生物標志物，用于評估肝臟纖維化和慢性肝病的嚴重程度[6]。本文將通過炎癥因子的檢測等方法進一步探討GDF-15可能對糖尿病誘導的肝損傷的保護作用。

1 資料與方法

1.1 模型建立及分組

C57BL/6J雄性小鼠(4～8周齡)60只(錦州醫科大學實驗動物中心提供)，體重18～22 g，適應性飼養1 w，隨機選取10只作為正常對照組，其余50只小鼠高脂飲食喂養2 w，腹腔注射STZ按(40 mg/kg體重)，每天監測血糖，當小鼠空腹血糖達到(≥12 mmol/L)時，為造模成功[7]。按體重選取狀態較好的小鼠30只隨機分為3組，繼續高脂飲食喂養30 d，具體分組及處理方法，見表1。

表1 動物分組及處理因素

1.2 取材及標本制備

小鼠眼眶取血，EP管收集血液，4 ℃冰箱靜止2 h，低溫離心取上清，-80 ℃冰箱保存備用。取血后小鼠灌流，立即取出肝組織，一部分稱重-80 ℃冰箱保存備用；另一部分修剪成1 cm3小塊，多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，用于HE和免疫組織化學染色。

1.3 血糖和體重監測

每天監測小鼠空腹血糖和體重并做記錄，取體重和血糖變化最大的幾天(第1、3、7、14、30天)作為血糖和體重變化依據。

1.4 血清中ALT和AST含量的測定

取-80 ℃冰箱保存備用的血清，按照試劑盒說明書進行ALT和AST水平的測定。

1.5 肝組織中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK的測定

取各組小鼠凍存的肝組織40 mg，按肝組織重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入360 mL的生理鹽水，制成勻漿，4 ℃離心10 min，取上清即為10%的肝勻漿液，將其分成兩份，一份用于檢測TG、TC、SOD、MDA值；另一份用生理鹽水1∶9比例稀釋成1%肝組織勻漿液，測定HK、PK酶的活力，卡馬斯亮藍試劑盒測定蛋白濃度。

1.6 ELISA檢測血清和肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

取-80 ℃冰箱保存備用的血清和凍存的肝組織，ELISA檢測血清和肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，具體檢測方法按試劑說明書操作。

1.7 HE染色觀察肝組織形態學改變

石蠟切片二甲苯脫臘，梯度酒精浸水，蘇木素伊紅染色，脫水，中性樹膠封片，光鏡下觀察肝細胞形態改變并攝像。

1.8 免疫組化檢測肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達

采用二步法 DAB 顯色檢測。操作步驟按試劑盒說明書進行，其中一抗稀釋度為1∶200，以已知陽性片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.9 Western Blot方法檢測肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達

取凍存的肝組織，組織裂解，BCA法測定蛋白濃度，制膠，上樣，電泳，轉膜，封閉后加一抗，4 ℃孵育過夜，充分洗膜后，室溫下二抗孵育 1 h，使用凝膠成像系統進行拍照，并用 Image J軟件進行分析，結果以目的蛋白與β-actin相對表達量表示。

1.10 統計學方法

用SPSS 20.0統計軟件包對實驗數據進行描述性統計分析、方差分析等統計學處理，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體重檢測結果

各組小鼠體重檢測結果：正常組小鼠體重隨飼養時間增加；與正常組比較，模型組和PBS組小鼠體重隨時間明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠體重隨時間增加明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

2.2 各組小鼠血糖檢測結果

各組小鼠血糖檢測結果：正常組小鼠血糖趨于穩定狀態；與正常組比較，模型組和PBS組小鼠血糖隨時間明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠血糖隨時間增加明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表2 各組小鼠體重的變化

表3 各組小鼠血糖的變化

2.3 各組小鼠血清中ALT和AST檢測結果

各組小鼠血清中ALT和AST檢測結果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠血清中ALT和AST明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠血清中ALT和AST明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 各組小鼠血清中ALT和AST的變化

2.4 各組小鼠肝組織中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK檢測結果

各組小鼠肝組織中TG、TC、SOD、MDA、HK及PK檢測結果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠肝組織中TG、TC、MDA明顯增加，SOD、HK、PK明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠肝組織中TG、TC、MDA明顯降低，SOD、HK、PK明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)，見表5。

2.5 各組小鼠HE染色結果

各組小鼠HE染色結果見圖1。正常組肝細胞排列整齊，結構清晰，無病理改變；模型組和PBS組小鼠肝細胞出現大量脂肪空泡，提示糖尿病小鼠肝細胞中脂肪沉積；GDF-15組肝細胞中脂肪空泡明顯減少。

2.6 各組小鼠血清和肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6檢測結果

各組小鼠肝組織與血清中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)檢測結果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠肝組織與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠肝組織與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見表6～7。

2.7 各組小鼠免疫組化染色結果

各組小鼠免疫組化染色結果見圖2～4。正常組TNF-α、IL-1β、IL-6在肝血竇低表達；模型組和PBS組TNF-α、IL-1β、IL-6在肝細胞胞質高表達；GDF-15組TNF-α在肝血竇低表達，肝細胞胞質中未見明顯表達，IL-1β、IL-6在肝細胞胞質低表達。

表5 各組小鼠肝組織中TG、TC、MDA、SOD、HK、PK的變化

A代表正常組：肝細胞結構清晰正常；B代表模型組：肝細胞內見大量脂肪空泡；C代表PBS組：肝細胞內見較多脂肪空泡；D代表GDF-15組：肝細胞內見極少量脂肪空泡

表6 各組小鼠肝組織中促炎因子的變化

表7 各組小鼠血清中促炎因子的變化

A代表正常組，TNF-α在肝血竇中低表達；B代表模型組，TNF-α在肝細胞胞質內大量表達；C代表PBS組，TNF-α在肝細胞胞質內高表達；D代表GDF-15組，TNF-α在肝血竇中少量表達

A代表正常組，IL-6在肝血竇中低表達；B代表模型組，IL-6在肝細胞胞質內大量表達；C代表PBS組，IL-6在肝細胞胞質內高表達；D代表GDF-15組，IL-6在肝血竇中有表達，在肝細胞胞質內少量表達

2.8 各組小鼠Western Blot檢測結果

各組小鼠Western Blot檢測結果：與正常組比較，模型組和PBS組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，GDF-15組小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖5、表8。

圖5 各組小鼠肝組織TNF-α、IL-1β和IL-6的表達

組 別TNF-α/β-actinIL-1β/β-actinIL-6/β-actin正常組0.33±0.020.08±0.010.13±0.01模型組1.24±0.14**0.52±0.04**0.44±0.05**PBS組 1.12±0.08**0.43±0.03**0.32±0.03**GDF-15組0.54±0.03##0.14±0.01##0.23±0.02##

3 討 論

糖尿病肝損傷是糖尿病常見的并發癥之一。對于T2DM的發病機制，目前還未見明確的闡述，主要涉及以下幾個方面，如：糖脂質代謝異常、氧化應激、內質網應激、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、炎癥反應[8-10]等等。研究顯示，在糖尿病以及并發癥中發揮重要作用的是炎癥反應。當TNF-α、IL -1β、IL-6 等炎癥細胞因子大量釋放時，可導致糖尿病肝損傷加重，可由非酒精性脂肪肝病發展為非酒精性脂肪肝炎[11]。

轉化生長因子GDF-15在體內有廣泛的表達，其主要的分泌部位在肝臟和脂肪組織。有研究表明，GDF-15能使高脂飲食的小鼠體內脂肪含量降低[12]，同時可使機體能量消耗水平增加；還可通過抑制巨噬細胞活化減少炎癥的發生。機體炎癥反應時GDF-15水平會有代償性增高，推測GDF-15可能對機體具有一定保護作用[5]1-5。本實驗利用高脂飲食聯合STZ誘導C57BL/6J小鼠糖尿病模型，就有關GDF-15對糖尿病小鼠肝損傷的保護作用進行了初步探索研究。

ALT和AST可作為肝細胞損傷的診斷標準之一。本實驗血清中ALT、AST的檢測結果顯示，模型組明顯升高，GDF-15組明顯下降，說明GDF-15可明顯改善糖尿病小鼠的肝功能。肝組織中糖尿病脂質代謝指標TG、TC的檢測結果顯示：模型組明顯升高，GDF-15組明顯下降，說明GDF-15可改善糖尿病小鼠的脂質代謝。HK、PK是調控糖酵解的一種酶，肝組織中HK、PK的檢測結果顯示，模型組明顯降低，而GDF-15組明顯上升，說明GDF-15能維持糖尿病小鼠血糖的相對穩定。糖尿病小鼠抗氧化指標SOD、MDA的檢測結果顯示，模型組SOD表達明顯降低而MDA表達明顯升高，GDF-15組SOD表達明顯升高而MDA表達明顯降低，表明GDF-15可通過提高機體抗氧化來保護肝臟。

在各種促炎癥因子中，TNF-α是最重要的促炎介質之一，在胰島素抵抗的發生和T2DM的發病過程中發揮著重要作用。TNF-α主要產生于脂肪細胞和(或)外周組織，通過參與產生ROS和激活各種轉錄介導的通路，誘導組織特異性炎癥。TNF-α水平升高誘導脂肪細胞和外周組織的胰島素抵抗，通過絲氨酸磷酸化削弱胰島素信號，從而導致T2DM的發展。有文獻報道[13]，通過抑制促炎細胞因子的表達來預防1型和2型糖尿病。本實驗各組小鼠血清和肝組織中TNF-α、IL-6及IL-1β檢測結果顯示，模型組促炎癥因子表達明顯上升，GDF-15組促炎癥因子表達明顯下降；免疫組織化學染色和Western Bolt檢測肝組織中NF-α、IL-6及IL-1β表達結果顯示：模型組處于高表達，GDF-15組處于低表達。其實驗結果與已有文獻報道一致，說明GDF-15能抑制促炎細胞因子的表達。有關GDF-15介導改善糖尿病小鼠肝損傷的機制還需進一步的研究來闡明。