紅花龍膽組培快繁體系研究

鐘世浚 張碧東 賴世婷 劉華敏

（重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院，永川 402160）

紅花龍膽（Gentiana rhodantha）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gentiana）植物，分布于滇、川、貴、陜、隴、豫、鄂、桂等地，生長在海拔570～1 750 m 的高山灌叢、草地及林下［1］，是我國傳統(tǒng)的中藥材，其主要作用成分為環(huán)烯醚萜、裂環(huán)烯醚萜類及氧雜蒽酮類化合物［2］。全草入藥，具有清熱除濕、解毒、止咳的功效，能治濕熱黃疸、肺熱咳嗽、小便不利等癥［3］，市場需求量較大。此外，紅花龍膽花量大，花型秀美，花色艷麗，觀賞價值高，且其自然花期恰逢農(nóng)歷新年，具有作為年宵花的開發(fā)潛力。目前紅花龍膽還以野外采挖為主，長期采挖導(dǎo)致本來并不豐富的野外蘊藏量日益減少，為了減緩野外紅花龍膽減少的壓力，人工繁育技術(shù)的開發(fā)顯得越來越迫切。

目前關(guān)于紅花龍膽的研究，主要集中于資源調(diào)查［4］、化學(xué)成分分析［5～6］、藥理研究［7～9］及適宜生長區(qū)［10］等方面，而在組織培養(yǎng)方面的研究還未見報道。龍膽科植物自然繁殖受諸多因素限制，如條葉龍膽種子萌發(fā)最佳溫度達(dá)25℃［11］，滇龍膽種子干藏最多保持活力6個月［12］，線葉龍膽自然狀態(tài)下的結(jié)籽率低，存在嚴(yán)重的花粉限制［13］等。紅花龍膽主要使用頂芽扦插的方法進(jìn)行繁殖，但插穗選擇不當(dāng)容易造成生根遲緩及生長不良，有性繁殖栽培周期過長，受自然環(huán)境限制較大，分株栽培繁殖率低，且植株品質(zhì)較差，不適合大規(guī)模生產(chǎn)［14］。而組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)高，培養(yǎng)條件可控，能破除自然環(huán)境條件的限制，加速紅花龍膽的繁殖，因此對紅花龍膽的繁殖和推廣具有重要意義。盡管紅花龍膽的組織培養(yǎng)還未見報道，但是龍膽屬的其他種已經(jīng)有零星報道。目前對龍膽屬其他種的組織培養(yǎng)的研究，其消毒方法主要采用酒精—升汞組合消毒法，消毒劑毒性高，對環(huán)境污染大。此外，已報道的龍膽屬植物［15～17］及一些草本植物［18～19］培養(yǎng)基多探索6-BA 對不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響，在激素上的使用存在一定的局限性。廉玉姬等人探索了玉米素對草本植物朝鮮白頭翁不定芽增殖影響，并取得了較高的不定芽再生率［20］；吳麗芳等人探索并對比了6-BA 與玉米素對草本植物萬壽菊不定芽分化率的影響，發(fā)現(xiàn)在生長素種類相同的情況下，玉米素組的不定芽分化率普遍高于6-BA 組［21］；閆海霞等人探索了玉米素對草本植物永福報春苣苔不定芽增殖的影響，取得了較高的不定芽增殖系數(shù)［22］。本實驗以紅花龍膽葉片及帶節(jié)莖段為外植體，使用次氯酸鈉作為消毒劑，降低了對環(huán)境的污染；以玉米素（ZT）作為細(xì)胞分裂素，以期獲得較高的增殖系數(shù)，以此建立紅花龍膽的快繁體系，為紅花龍膽的快速繁殖奠定基礎(chǔ)。人工繁育的推廣可減少野外采挖，緩解野生紅花龍膽資源匱乏現(xiàn)狀，并為觀賞紅花龍膽的開發(fā)提供條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試紅花龍膽植株于2019 年4 月采集于四川省瀘州市古藺縣，移栽于重慶文理學(xué)院特色植物研究院的大棚中。實驗于重慶文理學(xué)院特色植物研究院的實驗室進(jìn)行。

1.2 實驗方法

1.2.1 外植體消毒處理篩選

采用生長健康的紅花龍膽帶節(jié)莖段和葉片為外植體，沖洗干凈后放入燒杯中，蓋上紗布用自來水沖洗45 min后置于超凈臺上。再經(jīng)5%、8%次氯酸鈉溶液振蕩消毒5、8、10 min后，無菌水振蕩清洗5～6次，每次不低于1 min，最后用無菌濾紙吸干表面水分，將其接入MS培養(yǎng)基上，每個處理接種3瓶，每瓶5片，3次重復(fù)，1周后統(tǒng)計外植體的污染率和褐化率。

1.2.2 外植體篩選

選用健康葉片與帶節(jié)莖段接種在附加IBA 濃度為0.30 mg·L-1，ZT濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg·L-1的MS 培養(yǎng)基（附加30 g·L-1蔗糖，6 g·L-1瓊脂，pH調(diào)至6.8～7.0，下同）上進(jìn)行最適外植體篩選，葉片和帶節(jié)莖段每梯度均接種5瓶，每瓶4片（段），2周后統(tǒng)計外植體的污染率和褐化率。

1.2.3 誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基篩選

使用帶節(jié)莖段為外植體材料，在MS 培養(yǎng)基中添加不同濃度ZT 和IBA，其中ZT 濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1，IBA 濃度為0.1、0.3、0.5 mg·L-1，每梯度接種5 瓶，每瓶接種6 個外植體，3 次重復(fù)，培養(yǎng)1月后進(jìn)行增殖出芽統(tǒng)計。

1.2.4 生根培養(yǎng)基篩選

將叢生芽分割為單獨的植株，并接種入添加IBA 濃度分別為0.1、0.3、0.5 mg·L-1的1/2MS 培養(yǎng)基（附加30 g·L-1蔗糖，6 g·L-1瓊脂，pH 調(diào)至6.8～7.0），每梯度接種5 瓶，每瓶接種3 個帶頂芽苗，3次重復(fù)，1個月后統(tǒng)計生根數(shù)量。

1.2.5 煉苗移栽

待幼苗長至4～5 cm 高時，從培養(yǎng)基中取出幼苗，用流水將殘留培養(yǎng)基清洗干凈后，將其放入裝有少量清水的瓶中。開蓋于培養(yǎng)室放置3 d，再將瓶轉(zhuǎn)移到室溫條件下繼續(xù)放置3 d 后，將其移栽到V草炭土∶V珍珠巖=2∶1的基質(zhì)中。

1.2.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度控制在（25±1）℃內(nèi)，光照強(qiáng)度1 500 lx，光培養(yǎng)時間16 h·d-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度次氯酸鈉對外植體消毒的影響

由表1 可得，次氯酸鈉濃度、消毒時間均與外植體的褐化率呈正相關(guān)。表明次氯酸鈉濃度越高、消毒時間越長對外植體毒害越大。8%次氯酸鈉的污染率雖然比5%次氯酸鈉更低，但褐化率卻大幅上升，達(dá)到80%以上。使用5%次氯酸鈉對外植體消毒時，隨消毒時間延長，污染率明顯降低，而褐化率升高不明顯。綜合各因素，帶節(jié)莖段與葉片的最適消毒處理均為5%次氯酸鈉處理10 min。

表1 消毒實驗Table 1 Test for disinfection

2.2 外植體篩選實驗

接種時葉片、帶節(jié)莖段均為翠綠狀；培養(yǎng)1 周后葉片明顯硬化，無愈傷增殖，帶節(jié)莖段有少量不定芽開始增殖；培養(yǎng)2 周后多數(shù)葉片完全褐化（見圖1A），帶節(jié)莖段的不定芽開始少量增殖（見圖1B）。

由表2可知，比較不同培養(yǎng)基中葉和帶節(jié)莖段各項數(shù)據(jù)，均表明葉的褐化數(shù)大于帶節(jié)莖段，而增殖數(shù)小于帶節(jié)莖段。經(jīng)兩種外植體褐化率的卡方測驗得出，3種培養(yǎng)基中帶節(jié)莖段的褐化率均極顯著低于葉片（P=0.000＜0.01），兩種外植體增殖率的卡方測驗得出，3種培養(yǎng)基中帶節(jié)莖段的增殖率均顯 著 高 于 葉 片（P處理1=0.002＜0.05，P處理2=0.016＜0.05，P處理3=0.024＜0.05）。

表2 外植體篩選實驗Table 2 Test for explants

2.3 不同濃度植物激素對不定芽誘導(dǎo)增殖的影響

將采集的紅花龍膽枝條進(jìn)行消毒后，剪取帶有一對葉的帶節(jié)莖段，接種于含有不同濃度的ZT和IBA 的培養(yǎng)基上。在外植體篩選實驗中發(fā)現(xiàn)，IBA 濃度相同時，較高的ZT 濃度，帶節(jié)莖段的不定芽增殖數(shù)更多，因此在后續(xù)不定芽增殖誘導(dǎo)濃度篩選實驗中，適當(dāng)舍棄低濃度ZT 組，向上擴(kuò)大ZT濃度篩選范圍。1周后，已有不定芽被誘導(dǎo)出并陸續(xù)增殖；經(jīng)1 個月不定芽大量增殖（見圖2）后對其增殖系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計（見表3）。

表3 不同處理對不定芽誘導(dǎo)增殖的影響Table 3 Effects of medium composition on shoots proliferation

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析紅花龍膽的不定芽增殖系數(shù)表明：處理4 的增殖系數(shù)比除處理1、5 外的所有處理組差異顯著，并且處理4 的叢生芽長勢最為健壯。比較各實驗因子的影響后，可篩選出適合紅花龍膽帶節(jié)莖段誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基組分為：基礎(chǔ)MS+0.1 mg·L-1IBA+2.5 mg·L-1ZT，此時外植體增殖系數(shù)最大達(dá)8.94。

2.4 不同濃度植物激素對紅花龍膽生根的影響

根據(jù)表4 及圖3 可得，3 種處理的生根率均達(dá)100%，隨IBA 濃度的增加，生根數(shù)雖然呈增多趨勢，但I(xiàn)BA 濃度過高會使根變短變細(xì)，比較各項因子影響后，可篩選出紅花龍膽最佳生根培養(yǎng)基組分為：1/2MS+0.3 mg·L-1IBA，此時平均生根數(shù)為34條，平均根長達(dá)2.7 cm。

表4 不同IBA濃度對生根的影響Table 4 Effect of IBA concentration on rooting of seedlings

3 討論

在現(xiàn)有報道中，多用酒精—升汞對龍膽屬外植體進(jìn)行消毒［23～25］。由于升汞具有較大的毒性，在現(xiàn)在的組織培養(yǎng)外植體消毒中已經(jīng)較少使用。堅龍膽組培的研究中［17］，張潔等人先用3%的次氯酸鈉溶液浸泡6 min，在無菌水沖洗3～5次后，再用3%的次氯酸鈉溶液消毒6 min 的方法進(jìn)行消毒；在高山龍膽組培的研究中［27］，顧地周等人用70%酒精涮洗30s 后，再用3%次氯酸鈉溶液浸泡10 min 的方法進(jìn)行消毒；在東北龍膽組培的研究中［28］，孫天國等人發(fā)現(xiàn)用70%酒精殺菌60 s 后，再轉(zhuǎn)入3%次氯酸鈉溶液中消毒長達(dá)25 min 時仍有污染；本研究綜合他們的方法并略做改進(jìn)，利用5%次氯酸鈉，消毒10 min，無菌水沖洗3～5 次，依然能對外植體進(jìn)行有效消毒，且更為方便快捷，污染率為零。

根據(jù)細(xì)胞的全能性，理論上任何完整的植物細(xì)胞都有形成新完整植株的潛力，但是在實踐中發(fā)現(xiàn)，不同器官的發(fā)育能力各不相同。在龍膽屬植物的組織培養(yǎng)中，張潔利用堅龍膽腋芽和頂芽［17］、張彩霞等人利用線葉龍膽根［24］、郭美等利用頭花龍膽莖段［25］都成功得到了再生苗。本研究分別利用紅花龍膽葉片、幼莖和中部帶節(jié)莖段為外植體進(jìn)行了實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅花龍膽的葉片和幼莖進(jìn)行消毒處理后容易褐化死亡，不適合作為組織培養(yǎng)的外植體，中部帶節(jié)莖段褐化率低，成活率高，適合作為外植體，這與郭美和張潔等人的結(jié)果相似。但在草龍膽［26］的研究中發(fā)現(xiàn)，幼莖可作為體胚誘導(dǎo)的外植體。在滇龍膽［29］的研究中雖然發(fā)現(xiàn)葉片可以分化出不定芽，但是分化率極低，這與本研究中葉片外植體高褐化率，低出愈率相吻合，且目前對龍膽屬植物的組織培養(yǎng)中，鮮少見到利用葉片外植體獲得再生植株的，可能與龍膽屬植物葉片含黃酮類物質(zhì)較多，容易褐化有關(guān)。

在張潔的研究中，堅龍膽培養(yǎng)1月的最大增殖系數(shù)為7.3［17］，最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA；在郭美的研究中，頭花龍膽的最大增殖系數(shù)達(dá)10.3［25］，最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg·L-16-BA+mg·L-1NAA。但是我們的最大增殖系數(shù)為8.94，相較頭花龍膽增殖系數(shù)較小。這可能因為不同植物對不同類型植物激素，或?qū)に夭煌瑵舛鹊捻憫?yīng)不同有關(guān)。

紅花龍膽的生根能力較強(qiáng)，在所有的生根培養(yǎng)基中生根率均達(dá)到了100%，且在其他的增殖培養(yǎng)基中亦有部分叢生苗生長出根，但是在添加不同濃度IBA 后，紅花龍膽生根數(shù)量略有差異，其中1/2MS+0.3 mg·L-1IBA最適合作為紅花龍膽生根培養(yǎng)基。郭美等人在頭花龍膽的組培實驗中［25］發(fā)現(xiàn)MS+0.1 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA 最適合生根，生根率達(dá)100%；席銀凱等人在滇龍膽的組培實驗中［29］發(fā) 現(xiàn)1/2MS+2.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA最適合生根，生根率亦達(dá)100%；張潔等人在堅龍膽的組培實驗中［17］發(fā)現(xiàn)1/2MS+0.1 mg·L-1IBA 最適合生根，生根率為93%。而我們的實驗結(jié)果表明，最適合紅花龍膽的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.3 mg·L-1IBA，生根率達(dá)100%。從以上報道中可見，不同品種龍膽屬植物均能獲得較高生根率，可能龍膽屬植物具有較強(qiáng)的發(fā)根能力。