超聲輔助提取紅花中主要活性成分的工藝優化

李 鈺 楊 曉 葉 霄 鄧潔瓊 黃位年 代 沙

（1. 四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，成都 610300；2. 四川省攀枝花市農林科學研究院，攀枝花 617000）

紅花（Carthamus tinctoriusL.）是菊科（Compositae）紅花屬（Carthamus）的一種薊狀自花授粉1 年生二倍體（2n=24）草本植物，該屬約25 種，我國僅有紅花一種。我國紅花種植面積約3.5 萬公頃，年產量約4 000 噸，主要分布于新疆伊犁和塔城區域。其干燥花為《中國藥典》（2020版）收錄的紅花藥材，傳統用藥以紅花干燥花瓣入藥。紅花的主要活性成分較多，已分離并報道的包含黃酮類物質、生物堿、脂肪酸、聚炔等200 多種化合物［1～2］。干燥花瓣主要活性成分為黃酮類化合物，包括查耳酮類化合物、山奈酚和槲皮素為基本母核的一系列衍生物、蘆丁、木犀草素等化合物［3］。

查耳酮類多為色素類成分，其中紅花黃色素是多種水溶性成分的混合物，通過進一步分離，1993 年首次分離得到羥基紅花黃色素A。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）為藥典規定的質量指標性成分，研究較為廣泛，醫學上主要集中于冠心病、腦血栓等血液循環疾病的治療及抗腫瘤、抗心腦血管病變和抗誘變等方面［4～6］。姜華、盛雨辰等人研究表明HSYA 可抑制血小板激活因子誘發的血小板聚集與釋放，可競爭性地抑制血小板激活因子與血小板受體的結合，在腦缺血性損傷動物模型中，HSYA 具有明顯的治療、防御和神經保護功能，可以顯著減少腦組織壞死面積，改善動物行為缺陷，預防缺血性腦梗塞［7～9］。同時，HSYA 還是一種應用較廣的天然食用色素，可用于各種糕點、糖果、清涼飲料各類食品和化妝品的高端著色劑，具有很高的實用價值。山萘酚衍生物山奈酚-3-O-蕓香糖苷和山奈酚-3-O-葡萄糖苷可抑制疼痛和水腫，具有鎮靜和抗炎的作用［10］。槲皮素及其苷類有抗炎、抗病毒、抗腫瘤的作用。木犀草素具有消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌等多種藥理活性［11］。

紅花中黃酮類生物合成途徑普遍認為其為復合型代謝路徑，分別經草莽酸途徑和乙酸—丙二酸途徑，由一個桂皮酰輔酶A和三個丙二酰輔酶A在查耳酮合成酶（CHS）的作用下生成查耳酮，再在相關酶的作用下轉化形成黃酮、異黃酮、花青素苷等各類黃酮化合物［1，12～14］（見圖1）。中藥是一個“多功效、多組分”的復雜體系，不同活性物質具有不同的藥理活性，不同提取方法會影響提取物的組成和各成份含量，從而影響提取物的功能活性。目前紅花黃酮類成分提取方法有水提法、微波輔助提取法、超聲輔助水提法、纖維素酶法提取等，且各學者評價指標中紅花黃酮類化合物種類不盡相同，導致提取工藝多樣化［3，15～18］。

紅花黃酮類主要成分為藥典規定成分HSYA，本試驗以紅花黃酮類及其代謝通路上相關化合物為研究對象，以HPLC測定紅花黃酮類主要化合物含量為評價指標，通過單因素試驗和響應面分析模型對提取工藝進行建立和優化，以期找到制備紅花主要活性提取物的最佳方法和工藝，為紅花品種改良及進一步開發利用提供實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花材料均由四川省農業科學院經濟作物研究所提供，采集于成都市青白江區姚渡鎮科研基地，于盛花期采摘后40℃烘干粉碎，過5 目藥典篩（0.18 mm孔徑），密封儲存于干燥器中備用。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）美國Fisher 公司；磷酸（色譜純）天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水（Milli-Q 純水系統）；對照品HSYA（CASNo：78281-02-4，批號：20120816）、山萘酚-3-O-蕓香糖苷（CASNo：17650-84-9，批號：20131021）、山萘酚-3-o-葡萄糖苷（CASNo：480-10-4，批號：20130124）；槲 皮 素（CASNo：117-39-5，批 號：20110926）購自上海永恒生物科技有限公司；對照品槲皮素葡萄糖苷（CASNo：482-35-9，批號：PS001041/PS0400-0020）、柚皮素（CASNo：480-41-1，批號：PS001115/PS0240-0025）、柚皮素查耳酮（CASNo：73692-50-9，批號：PS170320-04）、山萘酚（CASNo：520-18-3，批號：PS001201/PS0207-0025）購自成都普思生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200 高效液相色譜儀，G1314B VWD檢測器，Aglilent Chemstation 化學工作站；KQ-250VDB 雙頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HHS-11-4 恒溫水浴鍋（上海百典儀器設備有限公司）；T-214 電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；GZX-9146MBE 電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.3 方法

1.3.1 提取方式及溶劑的選擇

研究考察超聲提取和回流提取在不同提取溶劑（70%甲醇、70%酸性甲醇、70%乙醇、70%酸性乙醇）下對紅花黃酮類成分含量的影響。材料中黃酮類物質采用HPLC-UV 法測定，用外標法計算含量，重復3 次測定，取平均值。根據試驗結果選擇適宜的提取方法進行單因素試驗。

超聲步驟：精密稱取0.2 g 材料，加入70%的溶劑25 mL，稱重，70℃超聲45 min，超聲功率250 W，頻率45 kHz，超聲結束后冷卻溶液，冷卻后補重至原重，12 000 r·min-1離心3 min，取濾液，即得。

回流步驟：精密稱取0.2 g材料，精密加入70%溶劑25 mL 提取溶劑，稱重，70℃水浴回流45 min，冷卻后加溶劑補重至原重，12 000 r·min-1離心3 min，取濾液，即得。

HPLC 色 譜 條 件：Agilent XDB-C18 色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），體積流量V=1 mL·min-1，柱 溫30℃，進 樣 量10 μL，檢 測 波 長337 nm（見表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Sequence of gradient elution

1.3.2 提取方法的優化

1.3.2.1 單因素試驗設計

采用單因素試驗設計，研究考察兩種提取方法（超聲提取和回流提取）在不同提取溶劑（70%甲醇、70%酸性甲醇、70%乙醇、70%酸性乙醇）下對紅花材料黃酮類成分含量的影響。提取后，材料中黃酮類成分采用HPLC-UV法測定。

超聲法單因素試驗：分別對料液比（0.1∶25、0.2∶25、0.3∶25、0.4∶25、0.5∶25、0.6∶25 g·mL-1）、超聲溫度（25、40、55、70、85℃）、超聲時間（15、30、45、60、75、90 min）、溶劑百分數（0%、10%、30%、50%、70%、100%）、超聲功率（40%、60%、80%、100%，Max=250 W）、超聲頻率（28 kHz、45 kHz）進行單因素考察。

回流法單因素試驗：分別對料液比（0.1∶25、0.2∶25、0.3∶25、0.4∶25、0.5∶25、0.6∶25 g·mL-1）、回流溫度（40、55、70、85、100℃）、回流時間（15、30、45、60、75、90 min）、溶劑百分數（0%、30%、50%、70%、90%、100%）、溶劑pH（1、2、3、4、5、6.3）進行單因素考察。

1.3.2.2 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，利用Box-Behnken 試驗設計原理，以花瓣中主要黃酮類成分為響應值，以單因素結果所選因素為自變量，建立多因素3 水平試驗點的響應面分析試驗模型，并利用Design Expert 10.0 對結果進行多元線性回歸方程擬合，檢驗模型，對模型進行響應值預測，優化花瓣中主要黃酮類成分提取工藝條件，并進行驗證試驗。

1.4 統計分析

所有試驗均重復3 次。單因素試驗采用SPSS 22.0 軟件對數據進行One-Way 方差分析，采用Design Expert 10.0軟件對響應面試驗結果進行分析。

1.5 優化方法與藥典法比較驗證

取紅花材料分別用本試驗優化方法和藥典方法進行提取測定，比較不同提取方法中黃酮類成分提取率。

2 結果與分析

2.1 紅花提取工藝條件確定結果

2.1.1 紅花提取方法和提取溶劑的選擇

紅花中檢測的黃酮類成分指標有HSYA、槲皮素葡萄糖苷、山萘酚-3-O-蕓香糖苷、山萘酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、柚皮素查耳酮、柚皮素、山萘酚；不同提取方法各成分提取率如圖2：紅花中主要黃酮類成分為HSYA 和山萘酚-3-O-蕓香糖苷，兩者共同占比85%以上；山萘酚-3-O-葡萄糖苷和槲皮素葡萄糖苷含量較少，各占8%以下；槲皮素、柚皮素查耳酮、柚皮素、山萘酚提取率在1%以下忽略不計。結果顯示HSYA 對提取溶劑PH 較為敏感，在酸性提取溶劑條件下，提取率均極顯著降低，山萘酚-3-O-蕓香糖苷提取率則對PH無顯著變化，降低PH 有助于提高槲皮素葡萄糖苷和山萘酚-3-O-葡萄糖苷提取率。針對不同提取溶劑，超聲和回流提取效果差異不同。乙醇作溶劑時，超聲和回流HSYA 和山萘酚-3-O-蕓香糖苷提取率差異不顯著。甲醇作溶劑時，超聲HSYA 和山萘酚-3-O-蕓香糖苷提取率極顯著高于回流，因此選擇70%甲醇超聲作為紅花提取黃酮類成分的考察工藝，考察指標以主要成分HSYA 和山萘酚-3-O-蕓香糖苷提取率為工藝目標。

2.1.2 單因素試驗結果

2.1.2.1 料液比對提取紅花黃酮類成分含量的影響

隨著料液比增加，HSYA提取率逐漸降低，山奈酚-3-O-蕓香糖苷先升高，后降低。0.1∶25和0.2∶25時，HSYA 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率變化差異不顯著，當增加到0.3∶25 時，HSYA 提取率極顯著下降，山奈酚-3-O-蕓香糖苷變化不顯著，再繼續增大到0.4∶25時，山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率極顯著下降。因此選擇最佳料液比為0.2∶25 g·mL-1。

2.1.2.2 超聲溫度對提取紅花黃酮類成分含量的影響

溫度的增加會導致分子間運動加速，滲透和擴散速度加快，從而影響提取率［19］。隨著超聲溫度的增加，HSYA 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率變化呈現相同趨勢，先無顯著變化，40℃后提取率極顯著增加，最后趨于平衡。選擇考察超聲溫度為70℃。

2.1.2.3 超聲時間對提取紅花黃酮類成分含量的影響

超聲時間影響溶質溶出量，隨著超聲時間的增加，HSYA 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率變化趨勢相似。隨超聲時間增加，提取率增加，在30 min時達到最大值，隨后略有降低，但差異不顯著。因此，選擇考察超聲時間為30 min。

2.1.2.4 甲醇百分數對提取紅花黃酮類成分含量的影響

隨著提取溶劑甲醇百分數由0 增加到30%，HSYA提取率變化差異不顯著，隨后繼續增加甲醇百分數至50%，HSYA 提取率極顯著增加，隨后變化差異不大，但若用100%甲醇，因HSYA 為水溶性物質，此時HSYA 提取率會極顯著降低。山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率隨著甲醇由0%增加到50%，提取率逐步顯著提高，隨后趨于平衡。因此，選擇考察提取溶劑為50%甲醇。

2.1.2.5 超聲功率對提取紅花黃酮類成分含量的影響

超聲儀最大功率為250 W，隨著超聲功率的增加，HSYA 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率變化趨勢相似，均為逐漸升高，在80%時達到最大提取率，隨后略有降低。但整個過程變化差異均不顯著。因此，選擇考察超聲功率為80%。

2.1.2.6 超聲頻率對提取紅花黃酮類成分含量的影響

超聲頻率考察試驗中，HSYA、山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率均為45 kHz＞28 kHz，但差異不顯著。因此，選45 kHz作為超聲頻率。

2.1.3 紅花響應面試驗設計和結果

在單因素試驗基礎上，利用Box-Behnken 試驗設計原理，以紅花中主要黃酮類成分HSYA 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率為響應值，以料液比（X1）、超聲溫度（X2）、超聲時間（X3）、甲醇百分數（X4）、超聲功率（X5）5 個因素為自變量，建立5因素3 水平共46 個試驗點的響應面分析試驗模型，因素水平編碼見表2，試驗設計和結果見表3。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Experimental factors and levels used in response surface analysis

表3 響應面試驗方案與結果Table 3 Design and results of response surface experiment

2.1.3.1 紅花響應面試驗數據處理及數值分析

為了研究不同條件對紅花主要黃酮類成分HSYA 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷制備的影響和確定最佳提取條件，在單因素試驗的基礎上進行中心組合試驗（Box-Behnken），對工藝參數進行優化，試驗設計方差分析結果見表4～5。

表4 HSYA優化回歸模型方差分析Table 4 Analysis of varlance for the content of total HSYA in the extract with various extraction conditions

表5 山奈酚-3-O-蕓香糖苷優化回歸模型方差分析Table 5 Analysis of varlance for the content of total Kaempferol-3-O-β-rutinoside in the extract with various extraction conditions

以HSYA 為響應值時，模型的F-Value 值為121.43，Lack of Fit 值為2.24，試驗模型極顯著，失擬項不顯著，信噪比37.861，變異系數3.02%，表明數據集中，離散程度小，擬合方程滿足響應面分析的要求。此時所得HSYA提取率（Y）對料液比（X1）、超聲溫度（X2）、超聲時間（X3）、甲醇百分數（X4）、超聲功率（X5）的二次回歸方程為：Y=1.58 167-0.53 720X1-0.00 524 603X3+ 0.021 834X4- 0.00 698 661X5-0.022 143X1X4+0.0 000 964 286X4X5+3.61 310X12+0.000 112 434X32-0.000 250 097X42。模型的校正決定系數R2Adj=0.9601，說明該模型能解釋96.01%響應值的變化；決定系數R2=0.9681，說明該模型擬合程度較好，可用于模型分析和預測HSYA 的提取率。根據F值和P值確定影響HSYA 提取的主要因素為甲醇百分數＞料液比＞料液比與甲醇百分比的交互作用＞甲醇百分數與超聲功率的交互作用＞超聲時間＞超聲功率。

以山奈酚-3-O-蕓香糖苷為響應值時，對多元回歸方程進行方差分析（見表4），此模型雖然失擬項顯著，但模型仍呈極顯著。變異系數5.77%，離散度減小，R2=0.899 8，調整決定系數RAdj2=0.884 4，信噪比為20.782，表明該模型能解釋88.44%山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量的變化，能在一定程度下對不同提取條件下的山奈酚-3-O-蕓香糖苷得率進行預測，模型可用。對回歸方程系數進行顯著性檢驗，甲醇百分數（X4）、X42為極顯著項，X22這2 項為顯著項，表明甲醇百分數對山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率具有極顯著影響，但甲醇百分數、超聲溫度對提取率的影響不是簡單的線性關系。此時所得山奈酚-3-O-β-蕓香糖苷提取率（Y′）對料液比（X1）、超聲溫度（X2）、超聲時間（X3）、甲醇百分數（X4）、超聲功率（X5）的二次回歸方程為：X′=-1.65 562+0.036 282X2+0.041 308X4+0.017 893X5-0.000255291X22-0.000348251X42-0.000116518X52。影響山奈酚-3-O-β-蕓香糖苷提取的主要因素為溶劑甲醇的百分數。

2.1.3.2 交互作用對紅花HSYA 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷得率的影響

響應面3D 曲面的傾斜度可以確定兩因素對響應值的影響程度，傾斜度越高，陡坡越陡，說明兩者交互作用越顯著，顏色越深。等高線形狀也可以直觀地反映各因素交互作用對響應值影響的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則不顯著，等高線中最小橢圓的中心點即響應面的最高點［20-23］。由表4～5 方差分析可知，料液比與甲醇百分數、超聲功率與甲醇百分數對HSYA 提取率的影響存在極顯著的交互作用，其他因素間交互作用不顯著。在圖9～10 中表現為響應曲面坡度相對較陡，等高線比較密或呈橢圓形。交互作用中，甲醇百分數對HSYA 提取率的影響強于料液比，甲醇百分數對HSYA 提取率影響強于超聲功率。

2.1.4 優化提取工藝參數的驗證

通過Design Expert 10.0 分析預測所得最大響應值：HSYA 提取率1.756%，山奈酚-3-O-β-蕓香糖苷提取率1.539%，與之對應的預測工藝條件為：料液比0.1∶25 g·mL-1、超聲溫度71.091℃、超聲時間45 min、甲醇百分比56.806%、超聲功率71.087%（Max=250 W）。根據實際操作，對提取工藝進行處理，在料液比0.1∶25 g·mL-1、超聲溫度70℃、超聲時間45 min、甲醇百分比57%、超聲功率71%（Max=250 W）的條件下進行驗證實驗，檢測圖譜如圖11 所示，組份間分離效果好，HSYA 提取率實測值為1.74%，山奈酚-3-O-β-蕓香糖苷提取率實測值為1.53%，與預測的理論值相接近，驗證了此模型的有效性。

2.2 優化方法與藥典法比較驗證

由圖12 可知，4 個材料中優化后的提取方法HSYA 得率高于藥典中的提取方法，山奈酚-3-Oβ-蕓香糖苷提取率極限值高于藥典提取法，該方法在提取紅花中主要黃酮類成分具有一定的優越性，對紅花中主要黃酮類成分具有較好的提取性。

3 結論

通過HPLC測定，紅花花瓣中主要黃酮類成分為羥基紅花黃色素A 和山奈酚-3-O-蕓香糖苷，紅花中主要黃酮類成分為HSYA 和山萘酚-3-O-蕓香糖苷，兩者共同占比85%以上。本試驗在單因素試驗的基礎上進行5 因素3 水平46 個試驗點的響應面優化，得出影響羥基紅花黃色素A 提取率最主要因素為甲醇濃度＞料液比＞料液比與甲醇濃度的交互作用＞甲醇濃度與超聲功率的交互作用；影響山奈酚-3-O-β-蕓香糖苷提取率最主要因素為甲醇濃度。

紅花花瓣主要活性物質最佳提取條件為：料液比0.1∶25 g·mL-1、超聲溫度70℃、超聲時間45 min、溶劑為57%甲醇、超聲功率177W，所得羥基紅花黃色素A 提取率為1.74%；山奈酚-3-O-蕓香糖苷提取率為1.53%。

不同于其他物種，紅花中花瓣幾乎不含花青素，黃酮類物質主要由醌式查耳酮和黃酮醇組成［12，24］。醌式查耳酮是紅花花瓣顏色形成的主要物質，其紅色和黃色的染料都來自于醌式查耳酮一類［25～26］。花中主要黃酮類成分HSYA 和山萘酚-3-O-蕓香糖苷由同一代謝通路起源，在四羥基查耳酮（tetrahydroxy chalcone）下游分為兩條不同代謝支路，分別在相關酶的作用下代謝生成醌式查耳酮和黃酮醇及其糖苷。該方法能較好的提取其代謝通路中的主要活性成分HSYA 和山萘酚-3-O-蕓香糖苷，為產品開發、品種改良奠定一定研究基礎。