花粉塊內花粉粒形態觀察的掃描電鏡樣品制備方法

陸 敏 李西林 陸 雄*

（1. 上海中醫藥大學科技實驗中心，上海 201203；2. 上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203）

花粉是攜帶遺傳信息的雄性生殖細胞，具有很強的遺傳保守性和穩定性，許多細微的形態特征能明顯體現出種間的差異和生存信息，在遺傳學和分類學中具有重要的科學價值［1］。掃描電鏡由于分辨率高，立體感強，圖像直觀，已被廣泛運用于植物孢粉學形態的研究。

植物花粉可分為：①單粒花粉；②2 個以上的花粉粒集合在一起形成的復合花粉，包括2 合、4合、16 合、32 合花粉等，其中以4 合花粉最常見，以及許多花粉粒集合在一起形成的花粉塊，如蘭科和蘿藤科植物［2］。由于花粉塊表面具有粘膠物質，被包裹在內的帶有粘性的花粉粒緊密粘合在一起，不易分散，難以被直接觀察［3］。因此在掃描電鏡下花粉塊的形態以及花粉塊表面的花粉粒形態的研究報道較多，而對花粉塊內部的花粉粒的形態鮮見報道［4～8］。解決花粉塊內花粉粒的掃描電鏡觀察樣品制備方法這一技術難題，將大大促進植物花粉形態的研究，進一步為植物的分類和鑒定等研究提供科學依據。本研究在常規掃描電鏡樣品制備的基礎上，采用導電雙面膠拉斷暴露出花粉粒的方法，成功觀察到了花粉塊內的花粉粒的形態，取得了令人滿意的結果。

1 材料和方法

1.1 材料

蘭科（Orchidaceae）石斛組（Sect. Dendrobium）翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f.）來自于上海中醫藥大學中藥研究所，由上海中醫藥大學中藥學院李西林教授提供，并經上海中醫藥大學中藥研究所徐紅研究員鑒定。

1.2 方法

1.2.1 花粉粒的制備

從自然盛開的新鮮花朵上采集花粉塊，立即投入2.5%的戊二醛固定液（pH7.2），4℃，固定2 h以上；用0.1 mol·L-1PBS（pH7.2）洗3 次，每次10 min；1%餓酸后固定3 h；再用PBS 洗3 次，每次10 min；用30%、50%、70%、90%和100%酒精進行梯度脫水后，放入Leica EM CPD300全自動臨界點干燥儀中干燥。干燥后的樣品用導電雙面膠固定在樣品托上，在真空下（1×10-6kPa）干燥0.5 h，以增加樣品與導電膠的粘合度。用鑷子輕輕夾住樣品，向上拉，拉斷的組織一部分粘在導電膠上，另一部分在解剖鏡下使斷裂面向上，粘貼在導電膠上。樣品粘貼好后，在Leica EM ACE600離子濺射鍍膜儀中噴金，鍍膜厚度為22 nm，使用Quanta 250 FEG場發射掃描電鏡對樣品進行觀察并拍照，加速電壓為10 kV。

1.2.2 花粉塊的制備

從自然盛開的新鮮花朵上采集花粉塊，在解剖鏡下將花粉塊不同的面粘貼在導電膠上，立即在離子濺射鍍膜儀中鍍膜后在掃描電鏡下對樣品進行觀察和拍照。

1.2.3 花粉塊的大小測量

在100 倍的放大倍率下測量4 個花粉小塊的極軸（P）和赤道軸（E）的長度。

1.2.4 花粉粒的大小測量

在1 000 倍的放大倍率下選取20 粒花粉粒進行極軸和赤道軸長度的測量，P/E 表示花粉粒形狀：P/E 在2～1.14 為長球形；P/E＜1.14 為近球形；P/E＜0.88為扁球形；P/E＜0.5為超扁球形［9～10］。

2 結果與分析

2.1 翅萼石斛花粉塊形態

翅萼石斛花粉塊由4 個花粉小塊組成，離生，每2個一對，沿縱軸左右對稱。正面觀和背面觀均呈有弧度的香蕉形（見圖1：A～B），側面觀，一端膨大圓鈍，一端尖銳，酷似太極圖中的陰陽魚形狀（見圖1：C）。花粉小塊極軸長約為2 mm，中間的花粉小塊略長于兩邊的花粉小塊。正面觀中間的花粉小塊赤道軸長約為600 μm，兩邊的花粉小塊赤道軸長約為400 μm，反面觀則相反。放大后觀察到翅萼石斛花粉小塊表面的花粉粒排列緊密，表面平整，Ⅰ級紋飾呈不規則的多邊形，Ⅱ級紋飾為皺痕和類似于毛孔一樣的小細孔，推斷花粉塊表面覆蓋有粘膠樣物質，相鄰花粉粒間的接縫處也可見到明顯的粘膠物質（見圖1：D）。

2.2 翅萼石斛花粉粒形態

翅萼石斛花粉小塊的斷裂面上可見密密麻麻的花粉粒（見圖2：A～B），放大后顯示這些花粉粒是由4個單粒花粉形成的四合體結構，四合體間結合緊密，不易分開，表面具有較淺的腦紋狀雕紋，未見萌發孔。四合花粉近似于左右對稱，極面觀赤道軸長分別約為25 和20 μm，赤道面觀極軸長約為10 μm，形態為超扁球形（見圖2：C～D）。

3 討論

目前花粉塊內花粉粒的觀察通常使用化學試劑醋酸酐或檸檬酸將花粉塊上的花粉粒分解下來，在光學顯微鏡下進行觀察［11～12］。此方法由于放大倍數的局限，僅可對花粉粒的形態的進行初步觀察。趙昕梅等報道采用化學試劑分解花粉粒后，再按照掃描電鏡的樣品制備要求進行脫水、干燥等處理，由于花粉粒體積過小在制備過程中遺失，并未觀察到花粉粒［13］，表明此方法并不適合掃描電鏡下花粉塊中花粉粒的觀察。孫崇波等人報道通過鐵骨素蘭花花粉塊中散落出來的花粉粒，觀察到了類似四分體的結構［14］，但這種觀察是由于操作中的偶然性出現的，并沒有形成系統的方法。

對于組織內部結構的觀察，掃描電鏡通常的制備方法有：①內部結構剖出法，包括刀片切斷法、鑷子掰開法、雙面膠帶拉斷法、環氧樹脂割斷法以及冷凍割斷法；②管道鑄型法；③離子蝕刻法［15］。植物花粉掃描電鏡樣品制備方法的報道多集中于單粒花粉，既有花粉粒表面形態觀察的制樣方法［16～17］，也有花粉粒內層結構觀察的制樣法，例如花粉粒冷凍斷裂法、花粉粒冰凍蝕刻法、花粉粒樹脂斷裂法等［18～19］，但目前尚無針對花粉塊內花粉粒制備方法的報道。

本實驗以石斛屬植物中花粉塊體積相對較大的翅萼石斛為材料，采用導電雙面膠帶拉斷花粉塊的方法，暴露出花粉塊中的花粉粒，在掃描電鏡下清晰觀察到了翅萼石斛花粉粒的立體形態與其上的紋飾，并在掃描電鏡下首次證實了翅萼石斛的花粉塊是由單粒→四合體→花粉小塊→花粉塊的形式組成的。此方法簡單易行，操作方便，不需要額外的試劑和儀器，再進行一定的優化后，可作為掃描電鏡下觀察花粉塊中花粉粒形態的一種通用方法，將有助于對蘭科、蘿藤科植物的花粉形態進行進一步的深入研究。