水曲柳BZR1基因克隆及其表達模式分析

紀欣童 于 磊 詹亞光*

（1. 東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040；2. 東北林業大學生命科學學院東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

油菜素內酯（BRs）是一種植物特有的類固醇激素，在植物生長和發育過程以及對多種生物和非生物脅迫方面具有關鍵的作用［1］。24-表油菜素內酯（24-epibrassinolide，EBR）在穩定低溫脅迫下高山離子芥懸浮細胞膜系統的結構與功能方面發揮積極作用，從而保證細胞生理代謝的正常進行，以提高其抗寒能力［2］。BRASSINAZOLE RESISTANTANT1（BZR1）是調節BR 信號通路中的重要元件之一。BZR1與下游BR 調控因子的啟動子區域結合并抑制BR 生物合成基因的表達以降低BR 水平，進而影響植物的生長［3～6］。因此，BZR1參與的負反饋調節是保持BR 作用平衡的關鍵機制。除介導BR 信號，BZR1在植物響應內部和外部刺激的過程中對于維持植物的正常生長和發育尤為重要［7］。擬南芥BZR1 結合ABA 誘導型轉錄因子ABA INSENSITIVE 5（ABI5）的啟動子上幾個G-box 順式元件抑制ABI5表達降低植物對ABA 的敏感性，說明BZR1基因能夠介導BR與ABA 之間的信號傳導來促進植物響應生物和非生物脅迫［8］。在水稻中，BR 信號中BZR1直接促進OsmiR396d 的積累，OsmiR396d 通過調節不同靶基因的表達來控制BR 反應和GA 的生物合成，進而影響水稻的各種發育過程，提高水稻的產量［9］。擬南芥光受體光敏色素B（phyB）可直接與BZR1 的DNA 結合域相互作用，影響BZR1 在靶基因染色質上的累積進而影響BR 信號的轉導［10］。Guo 等［11］發 現 在 香 蕉 果 實 成 熟 過 程 中MaBZR1 充當乙烯生物合成基因的轉錄阻遏物，延長香蕉果實成熟的時間，提高香蕉果實的品質和營養。BZR1 通過依賴RBOH1 的活性氧（ROS）信號調節番茄的耐熱性［12］。Saha 等［13］研究了BZR家族轉錄因子在鹽脅迫、干旱和ABA 處理后下的表達模式，檢測了它們在不同器官中的組織特異性表達情況，結果表明BZR家族轉錄因子在抵抗各種脅迫中發揮多重作用。Lü 等［14］研究結果表明，在鹽脅迫下BpBZR1在白樺中的過表達導 致H2O2和MDA 的 積 累 降 低，SOD 和POD 活 性升高，保持較高的光合強度和較低的葉綠素降解速率，說明BpBZR1基因的過表達提高了白樺對鹽脅迫的耐受性。結合小泛素相關修飾物（small ubiquitin-like modifier，SUMO）是將環境信號轉化為細胞信號的重要機制，在鹽脅迫下，擬南芥植株BZR1 在細胞質中去SUMO 化，促進BZR1 靶向SUMO 蛋白酶ULP1a 的積累，從而抑制植株生長，而BR 處理可以促進ULP1a 降解，SUMO 化BZR1 積累并促進植株生長，增強植株響應鹽脅迫的能力［15］。但在木本植物中對于BZR1的研究報道較少。

水曲柳（Fraxinus mandshuricaRupr.）木犀科（Oleaceae）白蠟樹屬（Fraxinus），是我國東北特有的白蠟樹屬樹種之一，被列為國家二級保護的漸危種［16］。水曲柳在林業生產上具有重要的經濟價值［17～18］。然而，水曲柳容易受到一系列生物和非生物脅迫的影響，包括土壤含鹽量較高、寒冷時間長等因素。因此，研究關于水曲柳的生長及抗逆性的基因具有極其重要的意義。

本研究克隆得到水曲柳BZR1基因，并且命名為FmBZR1基因，進行生物信息學分析，并初步探究其在非生物脅迫及激素誘導下的表達模式。為深入了解FmBZR1基因在BR 信號通路的分子機理，挖掘和運用BR 對水曲柳的潛在作用提供理論依據。對提高水曲柳的品質以及水曲柳組培苗的擴繁具有極其重要的作用。揭示FmBZR1在非生物脅迫和激素信號下的表達特征。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的水曲柳種子取自東北林業大學實驗林場，將種子萌發所形成的水曲柳幼苗置于恒溫培養箱中培養，培養基質為V（營養土）∶V（蛭石）=3∶1，并調整培養箱維持溫度23±2℃以及濕度為60%～80%，日照16 h，保證植物正常生長。水曲柳幼苗培養至15 d 時，取長勢相近的植株分別用低溫（4℃）、NaCl（200 mmol·L-1）、ABA（脫落酸，100 μmol·L-1）、IAA（吲 哚 乙 酸，100 μmol·L-1）和GA3（赤霉素，100 μmol·L-1）處理。鹽脅迫使用澆灌法，對照組澆水處理；激素誘導使用葉面噴施方式，以0 h 未處理作為對照［19］。在正常條件下繼續培養，分別于處理后1、3、6、12、24、48 h 取水曲柳幼根、莖、葉等組織作為樣品，各3 次重復。-80℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

pMD18-T 載體、反轉錄試劑盒均購自TaKaRa（大連寶生物工程有限公司）。引物合成及基因測序由上海生工生物有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1FmBZR1基因的擴增

以水曲柳葉片為實驗材料，CTAB 法提取材料的總RNA。使用反轉錄試劑盒將提取的RNA 反轉錄成cDNA。利用本研究團隊之前獲取的水曲柳轉錄組，通過primer 5.0 軟件設計引物，并送生物公司合成，引物序列如表1所示?；厥占兓禺愋詳U增產物，pMD18-T 載體連接純化產物，轉化克隆進感受態細胞，送生物公司測序。

表1 FmBZR1基因序列克隆及熒光定量引物序列Table 1 Primers sequences for cloning FmBZR1 gene and fluorescent quantification

1.3.2FmBZR1基因的生物信息學分析

用DNAMAN 軟件分析得到的FmBZR1基因的核苷酸序列，并推測其氨基酸序列。FmBZR1蛋白的理化性質、親水/疏水性、信號肽的預測及分析以及跨膜結構預測和分析分別通過Protparam在線分析軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）、ProtScale 在 線 分 析 軟 件（http：//web.expasy.org/protscale/）、SignalP 在線分析工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、在線工具TMPred（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）進行分析。應用亞細胞定位在線分析工具Wolf psort（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）對Fm-BZR1蛋白進行分析。FmBZR1蛋白的二級結構應用GOR4 軟 件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）分析。Fm-BZR1 蛋白的保守結構域利用NCBI 數據庫Conserved Domain Seach Service（CD Search，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件分析。FmBZR1 蛋白的三級結構通過Swiss Model 在線軟件（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測。FmBZR1 氨基酸序列應用NCBI 數據庫Blast 進行同源序列比對，以及搜索不同物種中的同源基因和蛋白。先將氨基酸序列利用ClusalX 進行多序列比對的分析，然后通過MEGA5.0軟件Neighbor-Joining算法，構建系統發育進化樹。

1.3.3 水曲柳BZR1基因在非生物脅迫和激素信號下的表達分析

水曲柳實生苗分別在低溫（4℃）條件下和Na-Cl溶液澆灌條件下進行脅迫處理，分別噴施ABA、IAA、GA3三種激素進行誘導，處理時間為1、3、6、12、24、48 h；對照組不做任何處理，時間梯度同上。將水曲柳幼根、莖、葉等組織提取得到的總RNA反轉錄成cDNA，以此為模板進行熒光定量分析Fm-BZR1基因的表達量。內參基因為水曲柳微管蛋白基因α-Tubulin（Tu）［20］，引物見表1。PCR 反應體系如下：17.6 μL Master Mix，2 μL cDNA 模板，正反向引物各0.2 μL，用ddH2O 補足至20 μL。擴增反應利用Applied Biosystems7500 熒光定量PCR 儀進行，反應程序如下：95℃，30 s、95℃，5 s、60℃，34 s（共40 個循環）、95℃，15s、60℃，1 min、95℃，15 s。每份樣品進行3 次重復。目標基因表達水平運用相對定量的2-ΔΔCt法計算［21］。

2 結果與分析

2.1 FmBZR1基因全長的鑒定

用FmBZR1基因的特異性引物和之前實驗得到的cDNA 模板進行PCR 擴增。電泳結果顯示，可擴增出大小在1 000 bp 左右并符合預期的特異性片段（見圖1）。DNAMAN 軟件預測水曲柳Fm-BZR1基因片段大小為984 bp，氨基酸序列長度推測為327個氨基酸（見圖2）。

2.2 FmBZR1蛋白質理化性質的分析

利用Protparam 軟件分析FmBZR1蛋白質理化性質。FmBZR1 蛋白相對分子質量為35 092.31；不穩定系數是71.93；理論等電點（PI）為8.46；總平均親水性為-0.512，說明該蛋白為親水性蛋白。利用SignalP 工具的神經網絡預測FmBZR1 蛋白，結果表明該蛋白可能不存在信號肽。利用TMPred 分析FmBZR1 蛋白進行跨膜結構，結果表明，FmBZR1 蛋白中由內到外（i→o）4～24 位具有強烈的跨膜螺旋結構，說明該蛋白有由內到外的跨膜能力（見圖3）。利用在線工具Wolf Psort 對Fm-BZR1 蛋白進行亞細胞定位預測，結果顯示，該蛋白在分泌系統囊泡得分為48，在質膜得分為36，在細胞骨架得分為16，說明該蛋白主要存在于細胞質中。

2.3 FmBZR1蛋白質三級結構的分析

利用NCBI 數據庫Conserved Domain Search Service（CD Search）在線分析軟件，根據其催化殘基、輔酶結合位點、底物結合位點、抑制劑結合位點、四聚體接口對水曲柳FmBZR1、FmBZR2 蛋白的保守結構域進行預測（見圖4）。參考二級結構預測的結構域，運用Swiss-Model 在線分析工具對FmBZR1蛋白質的三級結構同源建模分析，并對建模結果采用分析軟件Swiss-Pdb Viewer 進行處理。FmBZR1 蛋白質的三級結構同源建模結果表明其氨基酸序列與模板蛋白序列（麥芽糖周質結合蛋白BZR1 蛋白）相似度達到87.34%，與二級結構特定結構域吻合（見圖5），且為螺旋—環—螺旋結構（見圖6）。

2.4 FmBZR1氨基酸比對及系統進化樹的構建

將NCBI 比對的氨基酸序列利用ClustalX 進行比對結果分析，結果表明，FmBZR1 蛋白 序列與11 個其他物種的BZR1 蛋白序列的相 似性較高（見圖7）。再運用MEGA5.0 軟件中的N-J算法構建系統進化樹（見圖8），結果表明，Fm-BZR1 蛋白與11 個物種的11 條蛋白序列相似性都比較高，大致分為兩大類。其中，FmBZR1 蛋白與樟子松（Olea europaeavar.sylvestris）、芝麻（Sesamum indicum）、丹參（Salvia splendens）、茄子（Solanum lycopersicum）、煙 草（Nicotiana sylvestris）、辣椒（Capsicum annuum）的BZR1 蛋白親緣關系比較近。

2.5 FmBZR1在非生物脅迫下的表達模式

水曲柳FmBZR1基因的表達量隨著非生物脅迫處理的時間的延長發生顯著變化（見圖9）。在低溫（4℃）處理后，FmBZR1基因的表達量隨著處理時間的變化，呈現先上調后下調再上調的變化趨勢。在處理6 h 后，FmBZR1基因的表達量達到上調表達峰值，最大的基因表達量為對照組的1.98 倍。在NaCl 處理后，FmBZR1基因的表達量出現先下調后上調再下調又上調的表達趨勢，整體呈現為先下調后上調的趨勢。在處理24 h 后，FmBZR1基因的表達量達到上調表達峰值，最大的基因的表達量是對照組的10.13 倍。結果表明，FmBZR1基因明顯響應了低溫（4℃）和NaCl 這兩種非生物脅迫，其中，FmBZR1基因對NaCl 的響應更加強烈。

2.6 FmBZR1在激素信號下的表達模式

水曲柳FmBZR1基因的表達量隨著不同激素信號處理的時間的延長發生顯著變化（見圖10）。在ABA 處理后，FmBZR1基因的表達量呈現先上調后下調的趨勢，在處理3 h 后達到下調表達峰值，最低表達量為對照組的0.52 倍；在處理12 h 后達到上調表達峰值，最高表達量為對照組的4.26倍。在IAA處理后，FmBZR1基因的表達量呈現先下降又上升最后趨于平穩的趨勢，在處理3 h 后達到最低表達量，為對照組的0.41 倍；在處理48 h 后達到上升表達峰值，最大表達量為對照組的1.44倍。在GA3處理后，FmBZR1基因的表達量在不同時長有顯著差異，在處理3 h后，基因表達量最低，為對照組的0.50 倍；在處理24 h 后，基因表達量顯著升高，為對照組的6.23 倍。結果表明，FmBZR1基因響應了ABA、IAA、GA3信號的刺激。

3 討論

BZR1是BR 信號轉導過程中的關鍵轉錄因子，BZR1的N 端有一個bHLH 結構域，可特異性結合到靶基因啟動子區的BRRE 元件，對不同的靶基因的表達起到抑制或激活作用進而影響BR 信號的轉導進而影響植物的抗逆性［22］。本研究通過生物信息學分析，確定FmBZR1 也有bHLH 結構，可以與下游基因啟動子元件結合從而發生作用。當然，探究BZR1具體如何對下游基因產生的影響還需要進一步的實驗驗證。

BZR1可直接與WRKY54轉錄因子互作，也可以促進轉錄因子CBF（C-repeat binding factor）、WRKY6以及ABA 受體PYL6等編碼基因的表達，表現出正調控擬南芥耐寒性［23］。寒冷和土壤含鹽量一直都是限制植物生長的重要因素。水曲柳幼苗在寒冷環境下極易受凍害，生長受到抑制，因此研究低溫對基因表達的影響極為重要。本研究在低溫（4℃）處理后發現，FmBZR1基因表達量整體呈現先上調后下調再上調的趨勢，在處理6 h 后，FmBZR1基因的表達量達到上調表達峰值，推測FmBZR1基因參與水曲柳抗寒脅迫中發揮重要作用。

通過對OsBZR1的過表達株系進行分析，發現BR 可顯著誘導OsBZR1 去磷酸化，鹽脅迫可以調控OsBZR1 蛋白的積累水平和磷酸化狀態，BR 正調控水稻的耐鹽性，鹽脅迫通過抑制BR 合成來限制水稻的生長［24］。水曲柳作為東北地區“三大硬闊”樹種之一，研究其基因對抗鹽脅迫的作用尤為關鍵。本實驗在NaCl處理后發現FmBZR1基因的表達量整體呈現為先下調后上調的趨勢。在處理24 h 后，FmBZR1基因的表達量達到上調表達峰值，最大的基因的表達量是對照組的10.13 倍，說明FmBZR1參與響應鹽脅迫。

已有多項實驗結果表明，幾種激素可以誘導BZR1基因表達。玉米ZmBES1/BZR1基因參與了玉米ABA 信號傳導途徑，且在不同器官和發育階段以及對ABA 信號的響應表現出很大的差異［25］。當存在GA 時，DELLAs 降解而激活BZR1-PIF4-ARF6 模塊表達以促進植物生長［26］。MdBZR1 和MdBZR1-2like 可 以 與MdGA20ox2和MdGA3ox1的啟動子結合并增強它們在蘋果中的表達從而加強GA 的生物合成，提高蘋果的耐鹽性［27］。本研究對FmBZR1在激素信號誘導下的表達模式進行了分析。結果發現，在ABA 處理后，處理3 h 后達到下調表達峰值，最低表達量為對照組的0.52 倍；處理12 h 后達到上調表達峰值，最高表達量為對照組的4.26 倍。在IAA 處理后，處理3 h 后達到最低表達量，為對照組的0.41 倍；處理48 h 后達到上升表達峰值，最大表達量為對照組的1.44倍。在GA3處理后，FmBZR1基因的表達量在不同時長有顯著差異，在處理24 h 后，基因表達量顯著升高，為對照組的6.23 倍。目前很多研究表明，BRs 整合了多種激素和環境信號的輸入最終影響BR 調節基因的激活或抑制。BZR1家族成員為信號級聯的組成部分，參與多種信號轉導。然而，水曲柳Fm-BZR1轉錄因子的分子機制及其參與的BR 信號通路仍需進一步研究。

本研究通過基因克隆得到了FmBZR1基因，片段大小為984 bp，編碼327個氨基酸。對水曲柳FmBZR1基因進行初步的生物信息學預測以及不同激素誘導下的表達模式的分析，結合水曲柳自身材料生長發育的特殊性進行綜合驗證，為進一步深入研究FmBZR1基因的功能以及BR 對于水曲柳的作用奠定了基礎。后期工作要繼續對水曲柳過表達植株、突變體植株或雜交種植株進行不同方面的研究，以探究FmBZR1基因所參與的信號通路對水曲柳生長發育的影響，進而為水曲柳的高效育種等提供理論支持與指導。