梁山慈竹DfMYB3基因克隆及啟動子分析

杜恬恬 李會萍 王博雅 歐 倩 黃 艷 曹 穎 胡尚連，2*

（1. 西南科技大學植物細胞工程實驗室，綿陽 621010；2. 四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術研究中心，綿陽 621010）

MYB轉(zhuǎn)錄因子是最重要的植物轉(zhuǎn)錄因子大家族之一，參與了植物生長的許多生理過程。第一個從植物中獲得的MYB基因是玉米的Clorless1（C1）轉(zhuǎn)錄因子［1］，隨后在棉花［2］、大豆［3］、擬南芥［4］等植物中的MYB 蛋白也被鑒定出來。MYB 轉(zhuǎn)錄因子結構域中包含DNA-Binding結構域，根據(jù)結構的不同，可分為1R-MYB、2R-MYB（R2R3-MYB）、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB 4類蛋白［5］，其中R2R3-MYB 是最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與了植物的生長發(fā)育調(diào)控［6］、次生壁的形成［7］、初級和次級代謝［8］、脅迫響應以及激素應答［9］等。如棉花R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子GhMYB7在棉纖維發(fā)育中高表達，GhMYB7過表達擬南芥會增加維管和胞間纖維的細胞壁厚度，以及激活次生壁生物合成相關基因的表達，導致纖維素和木質(zhì)素的異位沉積［10］。擬南芥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子AtMYB60在萵苣中抑制會花青素的合成，過表達AtMYB60會導致萵苣花青素的產(chǎn)生和積累受到抑制［11］。麻瘋樹R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子JcMYB1經(jīng)干旱、聚乙二醇、氯化鈉和冷處理后表達量均上調(diào)，ABA 和茉莉酸處理也可上調(diào)JcMYB1的表達，而乙烯不誘導Jc-MYB1的表達，揭示了JcMYB1在響應非生物脅迫中的重要作用［12］。

MYB轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫以及激素應答方面有較多的研究。Chen等通過對擬南芥全基因組的序列分析，在MYB 超家族中鑒定出126 個R2R2-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，大多數(shù)MYB基因能夠響應一種或多種激素以及脅迫應答［4］。芥菜BjMYB1-3和BjMYB1-4基因在擬南芥中的過表達表現(xiàn)出種子提前萌發(fā)、促進生長以及對滲透脅迫或高鹽脅迫的耐受性提高現(xiàn)象［13］。小麥TaMYB1基因在缺磷條件下表達量上調(diào)，過表達TaMYB1植株比野生型表現(xiàn)出更多的磷積累，提示TaMYB1在磷饑餓脅迫耐受性方面起關鍵作用［14］。過表達紫花扁豆R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子LpMYB1轉(zhuǎn)基因擬南芥可以提高耐鹽性和耐旱性，轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽勢也有所提高［15］。玉米ZmMYB30基因在脫落酸（ABA）、聚乙二醇（PEG）、NaCl、低溫4 種脅迫下表達水平均明顯上調(diào)，ZmMYB30轉(zhuǎn)基因擬南芥異位表達促進了植物的耐鹽性，同時非生物脅迫相關基因的表達量也有所增加，提高了植物的抗逆性［16］。

目前，MYB轉(zhuǎn)錄因子在水稻、擬南芥等模式植物和毛竹等散生竹中研究較多，但在梁山慈竹等叢生竹中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子的研究卻鮮見報道。梁山慈竹是我國主要經(jīng)濟竹種之一，廣泛分布于四川、云南、貴州、廣西等全國各地［17］，是一種優(yōu)良的筍材兩用竹種，具有纖維含量高且質(zhì)量好，生物量大等特點。本研究基于梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，從梁山慈竹葉片中克隆得到一個MYB 轉(zhuǎn)錄因子，命名DfMYB3，對其進行了生物信息學分析、亞細胞定位，以及啟動子分析，為將來進一步研究梁山慈竹DfMYB3轉(zhuǎn)錄因子的功能提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

梁山慈竹生長于西南科技大學生命科學與工程學院植物資源圃，葉片采集后迅速置于液氮中速凍，并于-80℃超低溫冰箱中保存。梁山慈竹當年生側(cè)枝條用于激素處理，分別用100 μmol·L-1的赤霉素（GA）、100 μmol·L-1的脫落酸（ABA）對梁山慈竹側(cè)枝條進行處理，以H2O 為對照，噴灑處理5 d，用于檢測DfMYB3基因的表達量變化。野生型煙草NC89 無菌苗由本實驗室保存，組培室中光照16 h/黑暗8 h生長。

1.2 試劑

RNA 提取試劑盒Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 購自OMEGA 公司，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script?RT reagent Kit prefect real Time，Genome Walking Kit 試劑盒以及pMD19-T 載體均購自Ta-KaRa 公司，PCR 擴增試劑盒Q5 High-Fidelity 2X Master Mix購自NEB公司，實時熒光定量PCR試劑盒SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）SuperReal購自天根公司。農(nóng)桿菌EHA105 菌株，DH5α 大腸桿菌感受態(tài)、pART27 載體以及改造過的pBI 載體由本實驗室保存。

1.3 方法

1.3.1DfMYB3基因克隆

葉片總RNA 由Omega Bio-Tec Plant RNA Kit試劑盒提取，之后用Prime Script?RT reagent Kit prefect real Time 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用Primer Premier 6.0 軟件設計特異性引物DfMYB3-F/R（引物序列見表1）。采用NewEnglandBiolabs（NEB）公司的Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 試劑盒，擴增DfMYB3轉(zhuǎn)錄因子。PCR 反應程序為98℃預變性30 s，98℃變性10 s，67℃退火20 s，72℃延伸40 s，30 個循環(huán)，72℃延伸2 min。擴增產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌，進行藍白斑篩選。將陽性單菌落菌液送至上海英濰捷基公司進行測序。

1.3.2 DfMYB3生物信息學分析

用NCBI 在線工具Conserved 對DfMYB3 進行保守結構域預測分析。用ProtParam 在線工具對DfMYB3基因編碼的蛋白進行分子量、理論等電點、穩(wěn)定指數(shù)、氨基酸個數(shù)等理化性質(zhì)指標的測定。用SOPMA 在線工具對DfMYB3蛋白進行二級結構預測。SWISS-MODE 在線工具對DfMYB3 蛋白進行三級結構預測。以DfMYB3 的氨基酸序列為探針，從國家水稻數(shù)據(jù)中心、植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫、NCBI三種數(shù)據(jù)庫中獲得多條有功能的MYB序列，將氨基酸序列導入MEGA7.0篩選最適模型，采用最大似然法（Maximum Likehood）構建系統(tǒng)進化樹（Bootstrap 參數(shù)為1000）。用PlantCARE 在線網(wǎng)站對DfMYB3啟動子序列進行元件分析。

1.3.3 實時熒光定量PCR

用Omega Bio-Tec Plant RNA Kit 試劑盒提取GA、ABA 處理后的梁山慈竹側(cè)枝條RNA，用Prime Script?RT reagent Kit prefect real Time 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并利用Primer Premier6.0 軟件設計Df-MYB3基因的qRT-PCR 特異性引物RT-DfMYB3-F/R（引物序列見表1），以Tublin 作為內(nèi)參基因，Tublin-F/R 引物序列見表1。用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）SuperReal 試劑盒進行qRT-PCR 反應，分析DfMYB3基因的表達量變化情況。采用2-ΔΔCT對DfMYB3基因的相對表達量進行計算，并用Duncan法進行差異顯著性分析。

1.3.4 DfMYB3亞細胞定位

用BioEdit 軟件分析DfMYB3基因的所有酶切位點，用Primer Premier6.0 軟件設計特異性引物DfMYB3-F（KpnⅠ）和DfMYB3-R（HindⅢ）（引物序列見表1），與含有綠色熒光蛋白（GFP）的pART27載體連接。將重組質(zhì)粒DfMYB3-pART27 轉(zhuǎn)入水稻白化苗原生質(zhì)體中，以DAPI 細胞核染色作為陽性對照，在激光共聚集顯微鏡下觀察DfMYB3融合GFP蛋白的表達情況。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5DfMYB3啟動子克隆

梁山慈竹DfMYB3基因序列通過與毛竹的同源MYB 序列比對，設計3 條同向特異的引物SP1、SP2、SP3（引物序列見表1）。CTAB 法提取梁山慈竹葉片基因組DNA，以基因組DNA 為模板，利用染色體步移法克隆DfMYB3上游啟動子序列。Genome Walking Kit 試劑盒中的AP1、AP2、AP3、AP4引物與設計的3 條特異引物SP1、SP2、SP3 進行熱不對稱PCR反應。3次巢式PCR反應后可獲得Df-MYB3基因的側(cè)翼序列。

1.3.6DfMYB3啟動子轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得及GUS染色

用BioEdit 軟件分析DfMYB3啟動子的酶切位點，用Primer Premier6.0 軟件設計特異性引物pDf-MYB3-F（HindⅢ）和pDfMYB3-R（XbaⅠ）（引物序列見表1），將克隆得到的DfMYB3啟動子連接含有GUS報告基因的改良pBI 載體，構建pDfMYB3：：GUS 重組質(zhì)粒，通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。提取轉(zhuǎn)基因及野生型煙草植株的DNA，進行PCR陽性驗證。陽性轉(zhuǎn)基因煙草苗在GUS染液（1 mL磷酸緩沖液，0.1 mL TritionX-100，0.2 mL K3Fe（CN）6，0.2 mL K4Fe（CN）6，10.4 mg X-Gluc，補水定容至10 mL）中進行組織染色，37℃培養(yǎng)箱放置過夜，然后用卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）進行脫色。

2 結果與分析

2.1 DfMYB3基因克隆及生物信息學分析

基于梁山慈竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以梁山慈竹葉片為材料，克隆得到一個MYB 轉(zhuǎn)錄因子，命名為DfMYB3。測序結果顯示，DfMYB3基因的開放閱讀框長度為1 287 bp（見圖1A），編碼428 個氨基酸，GenBank 注冊號為KY963358。理化性質(zhì)分析顯示，DfMYB3 的分子量為47.33 KD，酸性殘基數(shù)大于堿性殘基數(shù)，理論等電點為6.12。穩(wěn)定指數(shù)結果顯示，DfMYB3 編碼的是不穩(wěn)定蛋白。Df-MYB3 的脂肪族氨基酸指數(shù)為65.00，總親水性平均系數(shù)為-0.644。保守結構域分析顯示，DfMYB3含有兩個典型的SANT 結構域（見圖1B），具有DNA-Binding 結構域。二級結構分析顯示，Df-MYB3 蛋白中無規(guī)卷曲含量最豐富，為60.51%，其次是31.78%的α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈含量最少，分別為3.97%和3.74%（見圖1C）。蛋白三級結構顯示，DfMYB3 蛋白的三維結構與B-MYB DNA結合域蛋白1a5j.1.A模型最為相似（見圖1D）。

系統(tǒng)進化樹分析顯示，DfMYB3 與甘蔗Sc2RMyb1，毛白楊PtoMYB216，擬南芥AtMYB55和AtMYB4，以及水稻OsMYB46 和OsMYB103L 聚集在一起（見圖2），同源性較高。這些物種的MYB 序列都屬于典型的R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子［18～19］，而且沒有單子葉、雙子葉植物的差異。

2.2 DfMYB3亞細胞定位

為了研究DfMYB3蛋白的亞細胞定位情況，構建了DfMYB3 融合綠色熒光蛋白（GFP）的重組質(zhì)粒DfMYB3-pART27，并轉(zhuǎn)入水稻白化苗原生質(zhì)體中進行瞬時表達。以DAPI 細胞核染色作為參照，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP 的表達情況。結果顯示，在細胞膜以及細胞核中都檢測到了GFP熒光信號（見圖3），但在細胞核中更為顯著。

2.3 DfMYB3啟動子克隆及元件分析

以梁山慈竹基因組DNA 為模板，利用染色體步移法克隆得到DfMYB3上游2 000 bp 左右的5′側(cè)翼序列。PlantCARE在線分析結果表明，該序列上含有啟動子元件TATA box、CAAT box，以及2 個脫落酸（ABA）響應元件ABRE、1 個生長素響應元件AuxRR-core，8 個茉莉酸甲酯（MeJA）響應元件CGTCA-motif 和TGACG-motif，1 個赤霉素（GA）響應元件GARE-motif，1 個水楊酸（SA）響應元件TCA-element，2 個干旱響應元件MBS，以及4 個光響應元件（見表2）。

表2 DfMYB3啟動子元件分析Table 2 Element analysis of DfMYB3 promoter

2.4 DfMYB3基因?qū)A和ABA處理的響應

啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，DfMYB3啟動子序列上存在多個激素響應元件。為探究DfMYB3對GA及ABA 處理的響應情況，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測了DfMYB3基因在100 μmol·L-1的GA、100 μmol·L-1的ABA 處理下的表達量變化情況。以水為對照，分別用100 μmol·L-1的GA、100 μmol·L-1的ABA 對梁山慈竹當年生側(cè)枝條進行噴灑處理，5 天后提取側(cè)枝條的RNA 進行qRT-PCR分析。結果顯示，GA 及ABA 處理均顯著上調(diào)了DfMYB3的表達。GA 處理后DfMYB3的表達量是對照的1.6倍，ABA處理后DfMYB3的表達量更高，達到了對照的7.6倍（見圖4）。

2.5 DfMYB3啟動子的功能分析

為研究DfMYB3啟動子的活性，構建了Df-MYB3啟動子融合GUS報告基因的pDfMYB3：：GUS 載體。通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了12 株抗性植株。DfMYB3啟動子序列的PCR 分析結果表明，有9株煙草抗性苗擴增出與陽性對照一致的特異性條帶，證實pDfMYB3：：GUS 已成功整合到煙草基因組中（見圖5）。GUS組織染色結果表明，在轉(zhuǎn)基因煙草葉片的主葉脈和次葉脈中有明顯的GUS 信號（見圖6A），但在莖桿中GUS 信號較弱（見圖6B）。對莖稈進行徒手切片后發(fā)現(xiàn)，在莖桿的表皮、皮層、維管組織以及髓細胞中均存在GUS信號（見圖6C～D），表明DfMYB3啟動子在煙草中沒有明顯的組織特異性（見圖6）。

3 討論

MYB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各種植物中，在植物的生長發(fā)育過程中起十分重要的作用。本研究克隆得到一個梁山慈竹MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為Df-MYB3。進化樹分析顯示，DfMYB3 與毛白楊、擬南芥等的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子聚集在一起。MYB 轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)結構域的不同可分為4 類蛋白，其中R2R3-MYB 是最大的一類MYB 蛋白，廣泛參與了一系列植物生理過程，包括激素應答［20］、脅迫響應［21］、次生壁形成［22］等。轉(zhuǎn)錄因子通常定位在細胞核中［23］，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，但也有轉(zhuǎn)錄因子同時定位于細胞核以及其他部位，如水稻的ASR蛋白同時定位于細胞核和細胞質(zhì)中［24］。丹參R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子SmMYB87 的亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，SmMYB87 蛋白在細胞核和細胞膜上均有分布［25］。本研究的亞細胞定位結果顯示，在細胞核以及細胞膜中均檢測到了GFP 信號，表明Df-MYB3蛋白在細胞核以及細胞膜中均有表達，但在細胞核中更為顯著。

啟動子是能夠調(diào)控基因表達的順式作用元件。藍莓VcMYB啟動子轉(zhuǎn)基因擬南芥能驅(qū)動GUS基因在擬南芥中表達，并且經(jīng)ABA、低溫和光照處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS 的表達活性增強［26］。海島棉MYB 轉(zhuǎn)錄因子GbMYB5基因的啟動子能夠驅(qū)動GUS報告基因在擬南芥的根部、葉尖部及生長點表達，推測該啟動子是一個組織特異性啟動子［27］。啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，DfMYB3啟動子序列上含有啟動子元件TATA box 以及CAAT box，具有典型的啟動子特征。DfMYB3啟動子轉(zhuǎn)基因煙草GUS 組織染色發(fā)現(xiàn)，GUS 信號在煙草葉片的葉脈以及莖桿中都被檢測到，在葉脈處最為顯著，表明DfMYB3啟動子具有啟動子活性，能夠驅(qū)動GUS基因的表達，且DfMYB3啟動子在煙草中沒有明顯的組織特異性。

研究表明，小麥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子Ta-MYB33，其啟動子序列包含ABRE、MYB 等非生物脅迫相關元件，過表達擬南芥增強了干旱和NaCl脅迫的耐受性，并且提高了滲透壓平衡重建和活性氧清除能力［21］。甘蔗脅迫相關的MYB 轉(zhuǎn)錄因子ScMYBAS1表現(xiàn)出對水分缺失和鹽脅迫的誘導反應，對啟動子PScMYBAS1的缺失分析表明，777 bp 或更長的啟動子片段在非生物脅迫（脫水、鹽、冷、傷）和激素（SA、MeJA）處理下，GUS 的誘導率增加了2～4 倍［28］。巴巴多斯棉R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子GbMYB60受ABA 以及鹽等脅迫誘導，GbMYB60轉(zhuǎn)基因擬南芥ABA 相關基因表達量下調(diào)，揭示了棉花GbMYB60基因可能通過抑制ABA 信號來負調(diào)節(jié)植物對鹽脅迫的耐受性［29］。煙草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子NtMYB44b經(jīng)100 mg·L-1GA、10 μmol·L-1ABA 處理后，相對表達水平顯著上調(diào)，推測Nt-MYB44b能對上述濃度的GA 及ABA 處理產(chǎn)生應答［30］。金魚草MYB 轉(zhuǎn)錄因子AmDIV的擬南芥同源蛋白AtDIV2參與了ABA 信號傳導，在外源ABA脅迫下，AtDIV2的表達水平顯著增加［31］。菊花R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子CmMYB2經(jīng)外源ABA 處理后，菊花葉中的CmMYB2表達量上調(diào)［32］。本研究的qRT-PCR 分析結果顯示，DfMYB3基因的相對表達量經(jīng)GA、ABA 處理后均顯著上調(diào)，表明DfMYB3基因能對GA 及ABA 處理產(chǎn)生應答。DfMYB3啟動子序列上存在MBS 干旱脅迫響應元件等，需要進一步的研究來探討DfMYB3是否在非生物脅迫中起作用。