龍膽個體發育早期器官發育形態學研究

王文穎 王秋紅 劉鳴遠 孫 閻*

（1. 黑龍江大學現代農業與生態環境學院，哈爾濱 150080；2. 哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，哈爾濱 150025）

個體發育是有機體與所處環境相互作用的過程，這一過程中的胚胎發育、種子形成、種子萌發至種苗形成均是處于營養發育的早期階段［1］，也是植物體根、莖、葉等器官分化的關鍵時期，應該成為探討系統發生的重要依據。胚胎發育是從一個受精卵（合子）開始經過多次細胞分裂，反復分化直至發育成成熟胚的過程［2］，它是在相對封閉的子房中進行的，主要受內環境影響，有利于保存祖先的孑遺原始性狀。種苗發育是從種子萌發至幼苗的形成過程，它是在開放的外界環境中進行的，主要受外環境影響，更多地體現后生性狀。被子植物營養發育中的胚胎發育后期至種苗發育初期［3～5］，即從內環境主導向外環境主導轉換階段，是前人研究工作中最薄弱的環節［1，6～9］。就是說在個體發育全過程中的這一階段還有一些重要的形態解剖學的信息亟待通過研究加以補充，這既是植物結構學的需要，也是了解植物個體發育全貌以及據此探討系統發育及生態演化的需要。

龍膽（Gentiana scabraBunge）又稱粗糙龍膽或龍膽草，為龍膽科（Gentianaceae）多年生草本植物，生于400～1 700 m 海拔的山坡草地、林緣及林下和草甸，見于我國東北、東部沿海和西南地區［10］。龍膽是黑龍江省優質地道中藥材“關龍膽”的重要藥源，以干燥根及根莖入藥，有瀉肝膽實火，清下焦濕熱之功效［11］。近年來，由于過度采挖，分布區日益縮小，被列為瀕危物種［12］。目前開展了相應的基礎生物學研究工作［13～14］，尤其是解決了龍膽種子育苗難題（萌發需要高溫高濕條件）［15］后其栽培規模逐漸擴大，適當緩解了龍膽草醫藥需求壓力。在對龍膽后續生物學的研究工作中我們曾發現其胚后發育有一些值得注意的特點，如根端發育滯后，提前產生根環和根環毛，以種子萌發的根尖為材料很難得到好的染色體分裂相等［16～18］。而根端發育滯后［3，19］、形成根環和根環毛是大多水生植物的特點［4，7～8］。為什么陸生植物龍膽會有這種現象？均未見相關報道。為此，我們對龍膽合子至種苗的發育過程進行了研究，以進一步揭示在器官發育順序及結構特點上鮮為人知的結構植物學問題。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料主要采自黑龍江省鶴崗市周邊山區，經哈爾濱師范大學王臣教授鑒定為龍膽（Gentiana scabra），憑證標本（230405180822006LY）保存于黑龍江大學現代農業與生態環境學院植物標本室。

用于胚胎發育時期的材料，從龍膽的始花期到果期（8月20日～10月8日）進行取材，每隔3～5 d取材一次，每次取不同大小的子房各2～4 個，取材后迅速用FAA（配比：70%酒精90 mL，冰醋酸5 mL，福爾馬林5 mL）固定并及時對材料進行抽氣處理，在固定24 h后轉入70%酒精中保存備用。

用于種子萌發觀察的材料在龍膽果實成熟時進行收集。采集開裂的蒴果20 個左右（每個蒴果含種子約2 500 粒），去除雜質后的凈種子自然干燥后放置于4℃冰箱保存。

用于電鏡掃描的材料則是取整個萌發的種子（種苗）進行固定。將材料置于2.5%戊二醛中固定，并緩慢抽氣使材料下沉，之后用0.1% mol·L-1的磷酸緩沖液3次，每次5 min，再經梯度濃度乙醇脫水（50%、70%、80%、90%、95%、100%），每一級脫水15 min。隨后用乙酸異戊酯置換，臨界點干燥法干燥后獲得樣品材料。干燥的樣品材料用雙面膠粘于樣品臺上，并在離子濺射儀Eiko IB-3 中進行導電處理，制成待觀察樣品。

1.2 方法

取一定量的種子置于帶兩層濾紙的培養皿（φ=90 mm）內，在室溫條件下進行發芽實驗。借助體視顯微鏡每天觀察種子萌發狀況后，取不同萌發過程的種子（種苗）經FAA（配比：50%酒精90 mL，冰醋酸5 mL，福爾馬林5 mL）固定24 h 后轉入70%酒精內保存備用。同時將一部分種子直播于帶土的花盆中，觀察種苗發育形態特征，并在北京泰克XTS-20體式顯微鏡下拍照。

不同發育時期的子房和萌發的種子材料固定處理后，利用常規石蠟切片技術切片，蘇木精整染及番紅復染，切片厚度8～12 μm。制成的裝片鏡檢后在LEICA-DM 4000 B LED 顯微鏡下觀察拍照。

制備好的電鏡掃描樣品材料最后在HITACHI S-4800 型掃描電子顯微鏡下觀察、拍照和記錄，加速電壓15 kV。

2 結果與分析

2.1 原胚發育特征

胚的發育從合子分裂開始，位于胚囊珠孔端的合子（見圖1：A）近圓形，細胞核體積較大，位于細胞中部，核仁明顯，細胞質濃厚。合子經歷近3 d的休眠期后才開始有絲分裂，進入原胚發育時期。合子第一次橫向分裂，產生一個近珠孔端的體積較大的基細胞（bc）和一個近合點端的體積較小的頂細胞（ac），基細胞和頂細胞共同組成2-細胞原胚（見圖1：B）。之后，基細胞和頂細胞再分別進行一次橫向分裂，分化為線形排列的4-細胞原胚（見圖1：C）。4-細胞原胚形成之后，近合點端的兩個細胞又進行了一次橫向分裂，形成線形排列的6-細胞原胚（見圖1：D）。接下來，靠近合點端的兩個細胞進行斜分裂，形成8-細胞原胚（見圖1：E）。隨后合點端的4個細胞通過多次的平周分裂，原胚體積不斷增大，表皮細胞分化明顯，發育為棒形胚（見圖1：F）、球形胚（見圖1：G）。隨著子葉原原基的分化，相繼構成了心形胚（見圖1：H）和魚雷胚（見圖1：I）。與此同時，2-細胞原胚時的基細胞，通過橫向分裂，形成單向排列的3～6 個胚柄細胞，與靠珠孔端的大孢子壁相連，其形態大小在魚雷胚時變小，呈現出一定的退化趨勢（見圖1：C～J）。因此，胚的發育模式屬于茄型胚（Solanad type）［20～21］。另一方面，初生胚乳核在2-細胞和4-細胞原胚時期，離原胚較遠，到了8-細胞原胚時，隨著細胞分裂增殖，以游離核構成的胚乳合胞體靠近并包圍初生球形胚，到了球形胚時期胚乳細胞分化出明顯的細胞壁，形成了胚乳細胞（見圖1：G），因此，發育模式符合核型胚乳［20～21］。到了心形胚和魚雷胚階段，原胚周圍的胚乳細胞被逐步吸收，原胚和胚乳體之間形成一圈明顯的空隙，沒有觀察到胚乳吸器（見圖1：H～J）。

種子自開裂蒴果散落時，種子胚的分化不完全，大部分處于魚雷胚時期，胚乳細胞中也積累較多的內含物，此時胚周圍的部分胚乳細胞解體（見圖1：I），被胚所吸收。

2.2 種子萌發及器官分化過程

龍膽種子萌發前經過形態后熟發育至成熟胚時期，其種子室溫浸水2 d 后，首先是胚體周圍胚乳逐漸水解成可吸收的液態（見圖2：A）；胚體吸收周圍的養分繼而兩片子葉逐漸加厚，長成長橢圓形，胚軸伸長，根端也開始分化（見圖2：B～C），此階段胚芽也未見發育（見圖2：B～C）。至第五天時可見胚根從種皮外的翅中伸出，主要是由下胚軸細胞持續生長使胚根的根端自種孔突破種皮，根端初步分化（見圖2：D）。胚根突破種皮后，在胚根和下胚軸的交界位置，接近下胚軸末端的細胞向外膨大形成一個環狀凸起，即根環（root collar）（見圖2：D～E）。隨后根環區域細胞外凸形成根環毛（collet hairs），在縱軸上可見根環毛由根環處的2～5 層表皮細胞外凸發育而成（見圖2：F～I），其長度逐漸超過胚根（見圖3：C～E）。這圈毛發生時可見胚根的根尖并未完全發育，明顯早于根毛的發育，所以不是根毛結構，因其由根環的表皮細胞外凸形成，故稱之為根環毛，亦稱下胚軸毛。根環毛較為密集，其細胞核常位于基部至中部（見圖2：H），這也與根毛完全不同，但根環毛在外形上與根毛類似（見圖2：J），均是表皮細胞外凸形成的管狀結構。

種苗子葉脫離種皮時，根環處的根環毛較為密集，包圍著胚根，并且長度甚至超過胚根，胚根先端雖然主要為分生細胞組成，但尚未見根尖分生區明顯分化。這些密集的根環毛常常伸入周圍介質中，明顯起到固定種苗的作用，這也使得平臥的種苗逐漸轉為直立狀態進行生長，此時根端的分生區細胞開始分化，正常根毛出現（見圖2：J）。

為了進一步了解龍膽的種子萌發形態學特征，利用掃描電鏡觀察了它們的萌發過程，結果如下。浸水第5 天可見下胚軸伸長使胚根突破種皮（見圖3：A），根端初步分化，并在下胚軸和胚根交界處出現呈環狀膨大的根環（見圖3：B，F），隨后根環處的表皮細胞外凸延長形成管狀的根環毛（見圖3：C～D，G），多而密集的根環毛包圍圓錐狀的胚根，此階段的胚根初步發育，其長度的增加主要靠分生區細胞數量增多來實現的，先端可見根冠結構。隨著種苗的進一步發育，胚根發育較快，其內部成熟組織出現，成熟區正常發育的根毛出現，此時的根環毛依舊保存完好（見圖3：E，H）。幼苗的根環毛剛出現后，子葉上的氣孔也逐漸發育可見（見圖3：I）。

子葉展開變綠時，也未見胚芽發育，但根發育較快（見圖4：A）。至第一對真葉可見時（見圖4：B），子葉狀態的種苗已經停留10 d有余，但其地下的胚根則持續生長，說明其苗端發育相對停滯。但在地上停滯發育的同時，地下的胚根（主根）在根端分生組織的作用下逐漸伸長，隨著正常根毛的出現，根環毛也逐漸萎縮（退化）（見圖4：A）。

3 討論

龍膽胚和胚乳的發育過程與已報道的龍膽屬（Gentiana（Tourn.）L.）胚胎學特征基本一致［22～24］，如種子含豐富的胚乳，胚乳發育為核型，胚的發育為茄型等。但是龍膽4-細胞原胚時期之后的第三次分裂不是4個細胞全部橫裂，而只有來源于頂細胞的兩個細胞進行橫裂，形成6-細胞原胚（見圖1：D）。這與龍膽屬的東北龍膽［22］、秦艽［25］、線葉龍膽［23］、以及條紋龍膽［24］相似，而與黑邊假龍膽［26］、喉毛花［27］和濕生扁蕾［28］不同，后三種植物的4-細胞原胚第三次分裂是4 個細胞全部橫裂形成8-細胞原胚。這樣的發育特性是否具有系統學意義，有待進一步研究評價［29］。

另外，龍膽種子離開母體時胚體的發育程度并不是球形胚階段，主要是心形胚和魚雷胚時期，因此，前人總結的龍膽屬胚胎學特征中關于“當種子散落時胚只發育至球形胚階段”［23］這一特點應該擴展至心形胚和魚雷胚階段。也就是說龍膽種子成熟時，其胚芽和胚根尚未分化，萌發前的種子其胚體需要進行形態后熟過程，豐富的胚乳中的內含物是這一過程完成的有利保障。

植物的根環和根環毛是最初在研究龍膽時發現的，主要是種子在地面萌發后看見的，但當時未對下胚軸末端這一環狀分布的長而密的毛給予重視，后來在根系發生與發展的研究時發現這圈毛在一些種類中也存在。隨后查閱文獻獲知，根環和根環毛在水、濕環境中的被子植物中是比較常見的原始性狀，如芡實［1］、澤瀉［3］、大花睡蓮［7］、慈姑［19］和龍舌草［30］等。并且這圈毛最初被誤認為是“根毛”［31］，后來根據其出現的時間和位置被界定為“下胚軸毛”［19，32］，而這圈毛是根環細胞外凸形成，根據根環的位置和已有研究報道［8，33～34］，今后稱之為“根環毛”將更為準確。也就是說水生被子植物種子萌發時一般都是在下胚軸末端產生根環和根環毛，并且苗端先發育，根端后發育，這些性狀應該可以作為判斷水生起源的特征組，是原始的遺傳性狀。正如陸生哺乳動物胚胎發育中出現的鰓裂，在演化上意味著其祖先曾經是水生的，而成體未見鰓裂并不等于它在系統發育中一直是陸生的，通過個體發育全面系統的研究，仍可根據早期出現的鰓裂作出判斷，在系統發生上先是水生，而陸生是后來發生的。看來，至少在上述個例的某些性狀上，被子植物營養發育也有重復系統發育的表現。另外，根環和根環毛的發育也是受特定基因調控的，其出現的密度和長度顯然更利于種苗初期固定于泥土之上，也使得種苗由平臥變為直立生長。根環毛的細胞核通常位于毛的基部至中部，似乎是個動態變化的過程，其是否具有類似于根毛的吸收作用，還有待進一步驗證。

龍膽自然分布于山坡草地、灌叢中、林緣及林下、草甸等，是偏旱的自然生態環境。其種子地面萌發，需要高溫高濕的環境，并且萌發時產生根環和根環毛以及蓮座狀的種苗適當耐水淹等，這些特點皆與水環境密切相關，應該是水生祖先孑遺性狀得以保留的表型特征，并不是簡單的適應性狀。龍膽的種子在成熟胚階段胚根的根端已初步分化，而苗端未見分化；種苗發育中根端入土發育成初生根，初生根產生分枝后，才有真葉的產生；幼苗無通氣組織，具完整的輸導組織，具氣孔和明顯加厚的角質層等，這些性狀顯然又反映其對現代偏旱環境的協調發展。總之，從生態演化的觀點來看，龍膽的早期營養發育，既反映其祖先的水生孑遺原始性狀，又反映了對現存偏旱生境的適應，它應該是水生起源的，是次生陸生的進一步演化。