良惡性肺結節CD31表達水平的影像空間異質性差異

洪俊杰，劉博樂，陳瑤，唐坤，薛蓓慧，吳孫婕，鄭祥武

溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.放射科；2.病理科

影像學檢查是肺結節診斷的主要手段。肺結節的及時檢出，尤其是良惡性準確鑒別診斷，是肺癌早期診斷與治療的關鍵[1-2]。前期研究發現良惡性結節的空間異質性差異可作為定性診斷重要依據，并推測肺結節內血供分布的差異是其病理基 礎[3-5]，但目前有關肺結節近遠心端空間異質性影像學特征尚缺乏病理學的依據。本研究旨在探討良惡性肺結節CD31表達水平相關的微血管密度 （microvascular density，MVD）近遠心端空間異質性差異，從而為良惡性肺結節的影像學空間異質性差異特征提供病理學依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2016年5月至2017年9月在溫州醫科大學附屬第一醫院行肺結節根治術患者的石蠟組織標本35例。所有病例均經手術和病理證實，術前均未接受過放化療。35例中，男20例，女15例；年齡42～77歲，平均65歲；肺結節最大徑1～3 cm，平均2.2 cm；其中鱗癌7例，腺癌23例，炎性結節5例。所有患者術后的肺結節標本，根據肺門與肺動脈血管走行方向，分別取其近心端與遠心端兩處的部分病理組織，然后用10%中性甲醛溶液固定4～ 8 h，再行常規石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 研究方法 采用SP法檢測所有標本CD31（武漢塞維爾生物科技有限公司）的表達水平。采用已知表達抗體做陽性對照，枸櫞酸緩沖液代替一抗作為陰性對照，染色方法和步驟均按說明書進行。CD31陽性反應物為淺棕至深棕色顆粒，分布在血管內皮細胞。任何被抗體染色的單個內皮細胞或細胞團，不管是否形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤細胞和其他連接組織有清楚界限，都認為是一個可計數的微血管。根據Weidner校正方法[6]，在顯微鏡下對所有染色的切片進行微血管計數。每個切片首先在低倍鏡下觀察，找到切片微血管密集的區域，然后擴大至高倍鏡下觀察，隨機選取5個視野進行微血管計數，取其平均值記為該病例近或遠心端的CD31-MVD值。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS23.0軟件進行分析。計量資料以±s 表示，采用配對t 檢驗及獨立樣本t 檢驗分析良惡性結節近心端與遠心端MVD組內及組間的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

CD31 在所有病例中均呈陽性表達，陽性反應物為淺棕至深棕色顆粒，主要存在于血管內皮細胞，見圖1。在惡性結節中，結節的近心端與遠心端的MVD差異顯著，近心端的MVD明顯高于遠心端（19.2±8.6 vs. 13.3±6.8，P ＜0.05)。在炎性結節中，近遠心端的MVD差異無統計學意義（P＞0.05）。良惡性結節組間，在近心端，惡性與炎性結節之間的微血管數目差異無統計學意義（P＞0.05）；在遠心端，炎性結節的MVD高于惡性結節，差異有統計學意義（28.2±10.0 vs. 26.8±3.0，P＜0.05）。

圖1 CD31在良惡性肺結節中的表達（SP染色，×400）

3 討論

肺結節的良惡性鑒別診斷一直是臨床與影像關注的重點與難點。早期明確病變性質對于臨床的決策至關重要。既往，在肺結節良惡性的影像學鑒別診斷中，PET以及CT增強的相關研究多數著重于結節代謝水平、強化程度、結節血供情況及其與時間的動態關系等特征，協助鑒別結節性質[7]。然而，良惡性結節的CT形態學征像及其強化特征仍有較多重疊，炎性肉芽腫類疾病也常在PET上表現出類似惡性結節的高代謝，使其鑒別肺結節良惡性的能力受限[8-9]。近年來，影像組學在醫學影像學領域的應用備受關注，它通過提取感興趣區內的高維度特征數據如紋理、組織直方圖、分形維等，來定量描述病變的異質性[10-13]。研究發現，腫瘤內不均質的紋理特征一定程度上可以反映腫瘤缺氧變性及壞死、腫瘤血管生成等腫瘤生物學特性，且與腫瘤葡萄糖代謝水平及腫瘤浸潤轉移等分期相關，并認為該分析手段在腫瘤的定性、分級與分期等方面均具有潛在的應用價值[14-16]。然而，尚未見有直接涉及與腫瘤血供方向相關的腫瘤影像空間特征研究。2015年，我們關于孤立性肺結節的放射性活性分布的研究發現，良惡性肺結節內18F-FDG的代謝空間分布明顯不同：惡性結節呈近心端高代謝，而良性結節，尤其是炎性結節趨向遠心端高代謝并可作為定性診斷重要依據[3]。2017年周妮娜等[17]關于分析良惡性結節病變代謝分布差異的研究也報道了相似的結 果。2018年，我們在能譜CT中也發現了惡性結節的碘濃度水平在近心端顯著高于遠心端的現象，并推測其可能與良惡性結節近遠心端血供差異相關[4]。

盡管如此，目前，有關肺結節近遠心端異質性研究均僅有影像學觀察性分析，尚缺乏相關的病理學研究佐證。為進一步分析良惡性肺結節近遠心端空間異質性差異的病理機制，本研究嘗試用CD31免疫組化染色來對肺結節內的微血管進行計數，并分析良惡性肺結節MVD近遠心端的差異。本研究發現惡性結節近心端的MVD顯著高于遠心端，這一結果支持我們前期研究中關于惡性病灶代謝和碘濃度空間分布不同的結論。腫瘤是一種血管生成依賴性疾病，腫瘤的MVD與一系列腫瘤生物學行為密切相關，在腫瘤的生長和轉移中起關鍵作用[18-19]。惡性結節與炎性結節的血供模式不同，惡性結節血供豐富，異常吻合多，血管基底膜不完整，主要由降主動脈的支氣管動脈供血[7，20]。惡性腫瘤細胞由于有趨向血供的特點，在生長時會向血供豐富的方向（即近心端）發展。因此腫瘤近心端的血供更加豐富。不過，本組炎性結節較少，其近遠心端的微血管數目之間并不具有顯著的差異，還有待進一步加大樣本驗證。另外，本研究還比較了炎性結節與惡性結節組間近遠心端的MVD差異，結果顯示炎性結節遠心端的MVD較惡性結節高，且差異具有統計學意義。本研究的創新處在于通過檢測良惡性結節近遠心端CD31-MVD表達水平，分析良惡性肺結節近遠心端血供空間異質性特征，為影像學良惡性肺結節的空間異質性差異提供病理學依據。與影像組學通過高維度特征數據來描述腫瘤空間異質性的方法相比，本研究的優勢在于更簡便直觀，臨床易于應用。然而，本研究的不足之處在于樣本量較小，尤其是炎性結節樣本更少。另外，在標本處理時，對近心端與遠心端的選擇具有一定主觀性，今后有必要進一步增加臨床樣本，甚或建立動物實驗模型予以驗證。

綜上所述，本研究一定程度上表明了良惡性肺結節CD31-MVD表達水平存有近遠心端空間異質性的差異，惡性結節近心端MVD高于遠心端，炎性結節遠心端MVD較惡性結節高，可為影像學良惡性肺結節的空間異質性差異特征提供病理學依據。