miR-155在血管緊張素II誘導的腎小管上皮-間充質轉化中的作用及其機制

石哲瑋，劉勝新，秦鋮璠，章柳萍，錢彩珍

1.溫州醫科大學附屬諸暨醫院 心血管內科，浙江 紹興 311800；2.溫州醫科大學 第二臨床醫學院，浙江 溫州 325035；3.諸暨市中醫醫院 心血管內科，浙江 紹興 311800

高血壓腎病初期主要表現為腎小管稀釋功能減退，隨著疾病的不斷進展，大量正常的腎單位受到破壞，引起腎臟彌漫性纖維化以及慢性腎功能不全，最終引起腎臟硬化萎縮[1]。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是導致高血壓腎病患者腎小管濃縮和稀釋功能下降的重要原因之一，同時也是誘導腎臟纖維化的重要病理過程[2]。血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統中重要的血管活性成分，是促進腎小管上皮細胞EMT改變以及腎臟纖維化進程的關鍵調節因子[3]。給予體外培養的NRK-52E腎小管上皮細胞適宜濃度的Ang II處理可促進腎小管上皮細胞形態學以及EMT相關蛋白表達水平改變[4]。因此，本研究通過給予體外培養的NRK-52E腎小管上皮細胞Ang II處理誘導腎小管上皮細胞EMT過程，從而構建高血壓腎病細胞模型。

miRNA是短的單鏈RNA序列，在生物系統中廣泛表達，其主要作用為調控基因在多種生理和發育過程中的表達[5]。既往研究表明miR-155在多種心血管相關疾病中發揮重要的調節作用。WANG等[6]的研究表明，下調miR-155表達可以保護C57BL/6小鼠免受脂多糖感染引起的心臟功能障礙并減少心肌細胞凋亡。ZHANG等[7]的研究表明，miR-155可以減少氧化修飾低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞凋亡，從而延緩動脈粥樣硬化的形成。ZHANG等[8]的研究結果表明，miR-155可作為改善高糖誘導的心臟纖維化的治療靶點。本研究進一步觀察miR-155在調控腎小管上皮細胞EMT過程中的作用并探究其可能的信號轉導機制，從而為延緩高血壓病誘導的腎臟纖維化以及尋找新的高血壓腎病治療靶點提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：NRK-52E腎小管上皮細胞購自中國科學院上海細胞所，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養液培養并置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱中。定期更換細胞培養液，當細胞密度達到70%～80%時，進行傳代。

1.1.2 實驗材料和儀器：Ang II購自北京索萊寶科技有限公司；SC79購自美國MedChemExpress公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；Collagen I、N-cadherin、α-SMA、TGF-β和GAPDH抗體購自美國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒、CCK8和RIPA細胞裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL超敏發光液購自美國Thermo Fisher公司；反轉錄試劑盒購自上海東洋紡生物科技有限公司；Mastercycler X50熒光定量PCR儀購于德國 Eppendorf公司；ChemiDoc XRS+System曝光儀購 于美國Bio-Rad公司；BX63 熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 模型構建及細胞分組：體外培養NRK-52E腎小管上皮細胞，以每孔5 000個細胞的濃度接種到96孔板中。用10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10mol/L濃度的Ang II處理NRK-52E腎小管上皮細胞48 h，選取最宜濃度進行后續實驗。

將細胞分為對照組、Ang II組、NC miRNA處理 組、miR-155 inhibitor處理組、溶劑對照組和蛋白激酶B（AKT）激動劑處理組。對照組NRK-52E腎小管上皮細胞給予單純更換培養基處理；Ang II組給予10-7mol/L的Ang II處理48 h誘導EMT過程；NC miRNA處理組和miR-155 inhibitor處理組在給予NC miRNA和miR-155 inhibitor預處理6 h后予10-7mol/L的Ang II處理48 h。溶劑對照組在miR-155 inhibitor預處理6 h后，給予含10-7mol/L的Ang II和4 μL/mL DMSO的完全培養基處理48 h。AKT激動劑處理組在miR-155 inhibitor預處理6 h后，給予含10-7mol/L的Ang II和4 μg/mL AKT激動劑SC79的完全培養基處理48 h。

1.2.2 CCK8實驗測定細胞增殖活性：將CCK8染料加入96孔板內并孵育3 h，通過檢測490 nm處的吸光度來評估存活的細胞數。共重復3次，評估各組細胞增殖能力。

1.2.3 qPCR檢測細胞內miR-155表達水平：給予NRK-52E細胞不同處理后，提取細胞內總RNA并測定濃度及純度，按反轉錄試劑盒說明書中的操作步驟合成cDNA，通過Eppendorf MAS熒光定量PCR分析系統進行檢測，以U6為內參照，miR-155的相對含量以2-ΔΔCt表示，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測細胞內蛋白表達：給予NRK-52E細胞不同處理后，吸去上清液。加入蛋白裂解液，刮取貼壁細胞并吸入離心管中，離心后取上清液并測定總蛋白含量，經凝膠電泳分離和轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3遍后分別加一抗GAPDH（1:5 000）、Collagen I（1:1 000）、 N-cadherin（1:1 000）、α-SMA（1:1 000）、TGF-β（1:1 000）、p-AKT（1:1 000）和AKT（1:1 000），4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，洗膜3次后用ECL試劑顯影曝光。Collagen I、N-cadherin、α-SMA和TGF-β以GAPDH蛋白條帶作為參照，p-AKT以AKT蛋白條帶作為參照，通過Bio-Rad凝膠成像系統掃描，ImageLab圖像軟件定量分析每個條帶灰度值。

1.2.5 免疫熒光染色檢測Collagen I表達：給予NRK-52E細胞不同處理后，棄去原培養液，用PBS洗滌3次，在4 ℃環境中用4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌3次后，用0.3% TritonX-100溶液破膜15 min。 再用PBS洗滌3次后，用5%牛血清白蛋白封閉1 h，滴加Collagen I（1:100）一抗稀釋液后4 ℃過夜。第2天取出孵育盒，用PBS洗滌3次后，給予熒光二抗孵育1 h，再用PBS洗滌3次。最后用DAPI染核10 min 并滴加熒光猝滅劑后熒光顯微鏡下觀察熒光染色結果并拍照。

1.3 統計學處理方法 用SPSS22.0統計軟件進行分析。數據采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 不同濃度Ang II對各組NRK-52E腎小管上皮細胞增殖能力的影響

圖2 不同濃度Ang II對NRK-52E腎小管上皮細胞內EMT相關蛋白表達水平的影響

2.1 Ang II上調NRK-52E細胞增殖能力以及細胞內EMT相關蛋白表達水平 與對照組相比，給予NRK-52E細胞＞10-8mol/L濃度的Ang II處理可以顯著上調細胞增殖能力（P＜0.05），且隨著Ang II濃度的增加，NRK-52E細胞增殖能力逐漸增強，見圖1。由圖2可知，與對照組相比，給予NRK-52E細胞＞10-8mol/L 的Ang II處理可以顯著上調細胞內EMT相關蛋白α-SMA、Collagen I、N-cadherin和TGF-β蛋白表達水平（P＜0.05），且隨著Ang II濃度的增加，蛋白表達水平逐漸增加。以上研究結果表明給予10-7mol/L Ang II處理時NRK-52E細胞增殖能力以及細胞內EMT相關蛋白表達水平已顯著上調，且該刺激濃度較其他刺激濃度更為經濟實惠，因此，本課題組通過給予NRK-52E細胞10-7mol/L Ang II處理構建高血壓腎病細胞模型。

2.2 Ang II可上調NRK-52E細胞內miR-155表達水平 與對照組相比，給予NRK-52E細胞不同濃度的Ang II處理可以顯著上調細胞內miR-155表達水平 （P＜0.05），且隨著Ang II濃度的增加，細胞內miR-155表達水平逐漸增加，見圖3。

圖3 不同濃度Ang II對NRK-52E腎小管上皮細胞內miR-155表達水平的影響

2.3 下調miR-155表達可以抑制NRK-52E細胞內EMT相關蛋白表達水平 與對照組相比，Ang II組NRK-52E細胞內α-SMA、Collagen I、N-cadherin蛋白以及miR-155表達水平均顯著增加（均P＜0.05）；與Ang II組相比，NC miRNA處理組NRK-52細胞內α-SMA、Collagen I、N-cadherin蛋白以及miR-155表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與Ang II組相比，miR-155 inhibitor處理組NRK-52E細胞內α-SMA、Collagen I、N-cadherin蛋白以及miR-155表達水平均顯著降低（均P＜0.05），見圖4。

圖4 下調miR-155表達對NRK-52E腎小管上皮細胞內EMT相關蛋白表達水平的影響

2.4 下調miR-155表達可以抑制NRK-52E細胞內AKT蛋白磷酸化水平 與對照組相比，Ang II組NRK-52E細胞內AKT蛋白磷酸化水平顯著增加（P＜0.05）；與Ang II組相比，NC miRNA處理組NRK-52E細胞內AKT蛋白磷酸化水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與Ang II組相比，miR-155 inhibitor處理組NRK-52E細胞內AKT蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

2.5 上調AKT蛋白磷酸化水平可下調miR-155 inhibitor對NRK-52E細胞EMT過程的抑制作用 與miR-155 inhibitor處理組相比，溶劑對照組NRK-52E細胞內α-SMA、Collagen I、N-cadherin、AKT蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），AKT激動劑處理組NRK-52E細胞內α-SMA、Collagen I、Ncadherin蛋白表達以及AKT蛋白磷酸化水平顯著增加（均P＜0.05），見圖6。

3 討論

圖5 下調miR-155表達對NRK-52E腎小管上皮細胞內AKT蛋白磷酸化水平的影響

圖6 上調AKT同時抑制miR-155表達對NRK-52E腎小管上皮細胞內EMT相關蛋白表達水平的影響

高血壓是指以體循環動脈血壓增高為主要表現，同時可伴有心臟、腦和腎臟等全身器官功能性或器質性損害的臨床綜合征[9]。原發性高血壓患者的體循環動脈血壓增高會引起腎小管功能損傷，導致腎小管濃縮以及稀釋功能下降，最終導致腎臟功能衰竭。

Ang II為強效血管收縮劑，在高血壓的病理生理過程中起著重要的調節作用。當Ang II與血管緊張素受體結合后可激活促纖維化細胞因子表達改變，導致上皮細胞內α-SMA、膠原蛋白等表達增多，進而誘導腎臟纖維化[5]。本研究給予NRK-52E細胞Ang II處理誘導其EMT過程，結果發現在給予腎小管上皮細胞不同濃度的Ang II處理后，細胞上清液的吸光度值隨著濃度的增加而增加，且細胞內TGF-β、Collagen I、α-SMA、N-cadherin蛋白表達水平顯著上調，表明Ang II具有促進細胞增殖以及上調細胞內EMT相關蛋白表達水平的作用。

既往研究表明，TGF-β可通過調控miR-155下調腫瘤蛋白P53誘導性核蛋白1（tumor protein p53-inducible nuclear protein 1，TP53INP1）蛋白表達水平從而促進肝癌細胞EMT過程[10]；TGF-β還可在上調miR-155表達的同時下調c-Ski蛋白表達從而誘導人冠狀動脈內皮細胞EMT過程[11]；miR-155也可在增強肝癌細胞侵襲和轉移能力的同時誘導肝癌細胞EMT過程[12]。本研究結果表明，Ang II可促進NRK-52E細胞內miR-155表達水平的上調，且在抑制NRK-52E細胞內miR-155表達水平后，Ang II對細胞內EMT相關蛋白表達水平的促進作用受到顯著抑制，提示Ang II可通過上調miR-155表達水平促進腎小管上皮細胞EMT過程，進而誘導腎臟纖維化的發生。

AKT是一種在葡萄糖代謝、細胞凋亡、增殖及細胞遷移等過程中起到重要作用的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶。既往研究表明，AKT通路參與了Ang II誘導的腎小管上皮細胞EMT過程[4]，而miR-155可通過PTEN-PI3K/AKT通路調控細胞增殖和遷移能 力[13]。本研究結果表明，下調細胞內miR-155表達 水平可顯著抑制NRK-52E細胞內AKT蛋白磷酸化水平，且在下調miR-155表達的同時上調AKT蛋白磷酸化水平，可恢復miR-155對細胞內EMT相關蛋白表達水平的上調作用，提示miR-155可通過上調AKT蛋白磷酸化水平誘導腎小管上皮細胞向著間充質細胞轉變。

綜上所述，本研究探討了miR-155在Ang II誘導的腎小管上皮細胞EMT過程中的調控作用及其可能的信號轉導機制，發現miR-155可通過調控AKT信號通路促進腎小管上皮細胞EMT進程，進而誘導腎臟纖維化的發生。