12個單核苷酸多態性位點與兒童急性淋巴細胞白血病易感性的關系

莫一嘯，王楨，王盼，沈樹紅，2

1.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童血液科，浙江 溫州 325027；2.上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心 血液腫瘤科，上海 200127

白血病是兒童惡性腫瘤疾病中最高發的疾病，發病率近4/10萬，其中急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）約占白血病患兒的70%[1-3]。近年來以危險度分層為指導的規范化治療不斷完善與改進，使得兒童ALL成為最可治愈的癌癥[4]。在我國，據SCMC-ALL-2005臨床研究報道，兒童ALL 5年生存率達80%[5]。盡管如此，ALL對每一個患兒及其家庭的影響和壓力仍巨大。最根本的解決辦法是防止ALL的發生，而預測ALL的發生是預防的基礎。近年來，隨著高通量基因分型技術的發展，為患兒生殖系細胞的遺傳變異即遺傳多態性的檢測提供了平臺。結合全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）更全面地揭示了人群間白血病易感性、預后與治療藥物毒性反應程度差異的原因[6-7]。

關于遺傳多態性與ALL易感性的關系，一方面通過對腫瘤發病相關的候選基因多態性位點角度，如ABCB1、MTHFR、FAS、FASL、CASP8、TERT、FOXO3、MMP等基因[8-15]。但這種通過候選基因的方法，通常只聚焦于特定基因，而不能全面系統公正地評價單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點多態性與疾病的關系。在GWAS研究中，通過對大量的SNPs位點進行分型，并設置非常高的有意義標準，從而能篩選出可靠的兒童ALL易感性位點。在此基礎上，2009年有研究進行了兩個針對所有ALL類型的全基因組關聯分析，共發現21個兒童ALL易感性位點[16-17]。而SNPs具有人群特異性，在上述21個GWAS報道的兒童ALL易感性位點中，僅位于ARID5B基因的rs10821936、rs10994982，位于IKZF1的rs4132601及位于CEBPE基因的rs2239633在中國人群中進行過驗證[18-19]，而其余位點均未見中國人群的報道。本課題組根據上述基于歐美人群的2個GWAS報道的兒童ALL易感性位點，結合實驗條件選取了13個候選位點，期望用我國人群驗證這些SNP位點是否提示中國人群ALL的發病。

1 對象和方法

1.1 對象 以2008年至2017年溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院收治的ALL患兒191例為病例組。以191例健康志愿者為對照組。本研究經溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院倫理委員會批準（審批號：LCKY2019-05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取：ALL患兒緩解期骨髓涂片及對照組志愿者口腔拭子分別采用QIAamp DNA Mini Kit（德國Qiagen公司，cat.no.51306）和北京天根公司口腔拭子基因組DNA提取試劑盒（cat.no.DP322）抽提基因組DNA。

1.2.2 SNPs分型檢測：基因分型方法參照美國Fluidigm公司提供的“Genotyping with Juno”說明書進行實驗，簡要實驗步驟如下：采用美國 Fluidigm公司定制的待測SNP位點靶向擴增引物，用Fluidigm公司定制的微流體動態芯片在JunoTM分析系統儀器上采用Juno96.96格式下進行SNP位點基因型檢測。收集到的數據在Fluidigm SNP Genotyping Analysis software v4.2上進行分析。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS24.0 軟件統計分析。計數資料用率表示；對對照組進行Hardy-Weinbreg平衡檢檢，以P＞0.05為樣本處于Hardy-Weinbreg平衡狀態；病例組及對照組基因型分布和等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗。基因多態性與ALL的關系采用logistic回歸分析計算OR 及95%CI。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 對對照組標本13個位點（見表1）進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，rs10849033的P值＜0.001，表明存在偏離，故將該位點剔除。其余位點均P＞0.05，表明不存在顯著偏離（見表2）。

2.2 13個SNPs位點與兒童ALL的關系 病例組及對照組的基因型分布，等位基因頻率及與兒童ALL易感性的關系見表3。病例組與對照組基因型分布存在差異的位點有位于ARID5B基因的rs10821936（P=0.001），位于IKZF1 基因的rs11978267（P ＜0.001）和rs4132601（P=0.001），位于KRTH5B基因的rs2089222（P=0.047），位于ZNF230 基因的rs2191566（P=0.003）。通過χ2檢驗風險等位基因在病例組與對照組的分布差異，病例組位于ARID5B基因的rs10821936位點風險等位基因C頻率明顯高于病例組（P＜0.001），rs10994982位點風險等位基因A頻率高于病例組（P=0.016）。位于IKZF1基因的rs11978267風險等位G頻率及rs4232601風險等位基因G頻率病例組均高于對照組（P=0.001，0.003）。病例組位于ZNF230基因的rs2191566位點風險等位基因C頻率明顯高于對照組（P=0.002）。

表1 候選SNPs位點信息

表2 對照組Hardy-Weinbreg平衡檢檢

通過logistic回歸分析各基因型與兒童ALL易感性的關系，結果顯示：位于ARID5B 基因的rs10821936位點CC基因型發生ALL的風險是TT基因型的3.192倍（95%CI=1.697～6.006），該位點攜帶風險等位基因C患ALL的風險是T的1.692倍（95%CI= 1.265～2.264）。rs10994982位點AA基因型患ALL的風險是GG基因型的2.022 倍（95%CI=1.131～3.614），該位點攜帶風險等位基因A患ALL的風險是G的1.425倍（95%CI=1.068～1.901）。位于IKZF1基因的rs11978267位點GA基因型患ALL的風險是AA基因型的2.584倍（95%CI=1.599～4.176），該位點攜帶風險等位基因G發生ALL的風險是A的1.965倍（95%CI=1.301～2.968）。rs4132601位點GT基因型患ALL的風險是TT基因型的2.417倍（95%CI=1.478～3.952），該位點攜帶風險等位基因G患ALL的風險是T的1.871倍（95%CI=1.225～2.857）。位于ZNF230基因的rs2191566位點，基因型CA患ALL的風險是AA的2.834倍（95%CI=1.302～6.169），CC基因型患ALL的風險是AA的3.648倍（95%CI=1.688～8.041），攜帶風險等位基因C的發病風險是A的1.599倍（95%CI= 1.179～2.169）。

表3 12個SNPs位點與ALL發病風險的關系

續表3

3 討論

2009年TREVI?O等[16]報道的基因組研究，揭示了ARID5B 基因中的SNPs位點rs10821936 及rs10994982與白血病易感性的相關性，且在驗證人群中還發現了這2 個位點與超二倍體型急性B系淋巴細胞白血病的發病相關。2013 年有研究對rs10821936在中國兒童ALL與健康人群中進行了驗證，證實該位點的風險等位基因T確實與兒童ALL發病相關，且與超二倍體型B-ALL的發病也相關[18]。2019年有研究對rs10994982位點在中國兒童ALL及健康人群中的多態性進行驗證，也得到了同樣的結論[19]。本研究再次驗證了這2個SNPs位點與中國兒童ALL易感性的關系，但因病例資料收集不完善，無法進一步驗證上述兩位點與超二倍體型B-ALL的關系。

IKZF1 基因變異在白血病發病過程中起重要作用。其體細胞突變會造成轉錄因子IKAROS編碼異常，造成造血細胞獲得干細胞特性，超表達黏附分子等，且往往與不良預后有關[20-21]。生殖系遺傳變異則往往與白血病易感性相關，TREVI?O等[16]與PAPAEMMANUIL等[17]的GWAS研究中分別報道了位于IKZF1 基因上的白血病易感性相關SNPs位點rs11978267與rs4132601。此前的研究結果中，未發現rs4132601與中國人群兒童ALL易感性的關系[18]。 本研究發現該位點的基因型分布及風險等位基因G在病例組與對照組中存在差異，且基因型GT患ALL的風險是基因型TT的2.417倍，攜帶風險等位基因G的患ALL風險是T的1.871。但純合基因型GG因病例數少不能得到更加肯定的結論，需要進一步擴大樣本量為該位點與中國兒童ALL易感性的相關性提供更有說服力的證據。位于IKZF1 的另一個單核苷酸多態性位點rs11978267，此前在歐洲人群、突尼斯人群、也門人群及伊朗人群中被報道為兒童ALL易感性位點[16，22-23]。在本課題中，我們發現rs11978267的基因型分布及風險等位基因G的頻率在病例組及對照組中存在差異，且基因型GA相對于基因型AA及攜帶風險等位基因G相對于A都有較高的患ALL風險，OR＞1.9。但風險等位基因G的純合基因型GG因病例數少，無法得到肯定的結論，需要進一步擴大樣本量。

ZNF230基因上的rs2191566被國外多個全基因組關聯分析報道與白血病易感性相關[16，24-25]，但該位點與中國人群兒童ALL的關系未見報道。本研究中我們得到其在病例組及對照組中基因型分布、風險等位基因C的頻率存在差異，且基因型CA、CC的ALL發病風險明顯高于AA，因此我們認為該位點是中國人群的兒童ALL易感性位點。位于KRTH5B基因的rs2089222位點，雖然在本次試驗中其基因型分布存在差異，但未看到風險等位基因頻率存在差異且各基因型未明顯增加發病風險，因此不認為該位點為中國兒童ALL易感性位點。

2013 年南京兒童醫院的一項570 例ALL患兒與673 例健康兒童人群的病例對照研究對歐美人群易感性相關的ARID5B（rs10821936）、IKZF1（rs4132601）及CEBPE（rs2239633）進行驗證，發現與歐洲兒童人群ALL易感性相關的CEBPE 基因的rs2239633位點在中國人群中未發現與ALL相關，在我們的試驗中也未發現該位點與白細胞易感性的相關性。南京兒童醫院分析其原因可能與中國人群在該位點上的表達連鎖不平衡有關，通過LD矩陣圖分析rs2239633所處的LD blocks在兩個人群中明顯不同[18]。

位于LOC102723724 基因的rs11155133位點，SIAT7C 基因的rs10873876 位點，KCNE4 基因的rs12621643位點，RYR2 基因的rs7554607位點及 KCNMB2基因的rs9290663位點在2009年的多協作組大樣本量基因組研究中報道為ALL易感性位點，而在本次試驗中未發現其與白血病的相關性，這可能與樣本量有限及中國人群中這些位點的表達差異有關，需要進一步擴大樣本量進行驗證[16]。

本試驗驗證了此前鮮有中國內地人群報道的兒童ALL易感性位點，位于ZNF230基因的rs2191566。同時我們再次驗證了已報道的位于基因ARID5B的中國人群ALL易感性位點rs10821936及rs10994982。此外根據實驗結果我們認為位于IKZF1 基因的rs4132601及rs11978267為潛在中國人群兒童ALL易感性位點，需要進一步擴大樣本量以驗證。

綜上所述，本研究明確了3 個ALL遺傳易感位點，這為白血病的診斷、治療及預防工作提供了一定的思路。隨著基因組研究的不斷深入，可遺傳變異導致的某些疾病易感性被越來越多的數據所證實。如何利用這些數據來預測其患病的風險是下一個突破的課題。同時很多易感性位點所在基因與疾病治療藥物敏感性也相關，進一步通過藥物基因組學的研究能為白血病的診治提供新思路[26]。