牡蠣及其酶解產物抗皮膚光老化的初步研究

呂佳桐，林海生, ，秦小明, ，章超樺, ，曹文紅,，高加龍,，鄭慧娜,

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室/廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室/國家貝類加工技術研發分中心 (湛江)/南海生物資源開發與利用協同創新中心，廣東 湛江 524088）

近年來，藥食同源的健康理念越來越深入人心。人們不僅對食品的營養和風味有要求，而且更注重食品的附加功能，因此功能食品迅速獲得了消費者的青睞[1-2]。在美容方面，維A 酸是迄今為止最有效的抗光老藥物[3]，可通過口服或涂抹使用，但其衍生物可引起肝損害、皮膚脫皮和胎兒畸形[4]，因此茶多酚、膠原蛋白肽、益生菌、蝦青素和微藻葉黃素等[5-7]被加入食品中，制成了多種具有美容功效而又無副作用的功能食品。藻類多糖、魚類膠原蛋白、貝類多肽具有多種生物活性，且在抗氧化和抗光老化方面效果顯著[8-10]。牡蠣 (Ostreidae) 作為我國第一大養殖貝類，目前已被證實具有生殖保健[11]、解酒護肝[12]、抗光老化[13]等生物活性，且牡蠣中的多肽也在動物實驗中被證實具有抗光老化功效[14-15]。UVB (Ultraviolet radiation B)是皮膚光老化的重要影響因素[8,16]，因此多數研究僅以UVB 照射建立皮膚光老化模型，但近年來UVA (Ultraviolet radiation A) 愈發得到研究人員的重視[17]，其穿透力更強，可作用于真皮層，增加基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases,MMPs) 表達，最終導致膠原降解。因此，本實驗通過模擬日光中UVA+UVB 比例，建立UVA+UVB 聯合照射的小鼠 (Mus musculus) 皮膚光老化模型，從小鼠皮膚的宏觀光老化程度、膠原蛋白和彈性蛋白的分布情況、皮膚的抗氧化能力、皮膚中MMPs 活性、牡蠣的抗炎效果等方面，初步探究了香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis) 及其酶解產物的抗皮膚光老化活性，篩選抗光老化的有效活性成分，為后續牡蠣活性成分的分離純化和抗光老化作用機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 SPF 級7 周齡雌性KM 小鼠 (體質量18～22 g)，購自廣州迪恩基因技術有限公司，動物許可證號SCXK (魯) 2014-0007，飼養溫度為18～22 ℃，濕度為50 %～60 %，光周期為12 h 明暗交替，普通維持飼料喂養。

1.1.2 原料及對照藥物 香港牡蠣 (購自廣東省湛江市水產品批發市場)；維A 酸片 (山東良福制藥有限公司)。

1.1.3 實驗試劑 動物蛋白酶 (30×104U?g?1，龐博生物工程有限公司)；總超氧化物歧化酶 (TSOD) 測試盒 (羥胺法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 測定試劑盒 (比色法)、丙二醛 (MDA) 測定試劑盒 (TBA 法)、羥脯氨酸 (Hyp) 測定試劑盒(堿水解法)、Masson 染色液 (南京建成生物工程研究所)；8-羥基脫氧鳥苷 (8-OHDG) 測試盒、基質金屬蛋白酶 (MMP-3、MMP-9) 測試盒 (江蘇酶免實業有限公司)；小鼠白介素6 (IL-6) 測試盒、小鼠腫瘤壞死因子α (TNF-α) 測試盒、轉化生長因子β(TGF-β) 測試盒 (江蘇雨桐生物科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色液 (南昌雨露實驗器材有限公司)；醛品紅染色液 (雷根生物技術有限公司)。

1.2 儀器與設備

LED 紫外燈 (深圳永霖光電有限公司)；Varioskan Flash 全自動酶標儀 (美國Thermo 公司)；UNIVERSAL 320R 臺式高速冷凍離心機 (德國Hettich 公司)；FE28 型pH 計 (瑞士Mettler Toledo 公司)；DF-101T 集熱氏恒溫加熱磁力攪拌器 (上海精宏實驗設備有限公司)；FD-551 大型立式冷凍干燥機 (東京理化器械公司)；DM2000 LED 顯微鏡 (德國Leica 公司)；JB-L5 石蠟包埋機 (武漢俊杰電子有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 1) 全牡蠣肉粉 (Oyster meat,OM) 的制備。采用新鮮牡蠣肉勻漿后冷凍干燥，其低、中、高劑量組分別命名為OM-L、OM-M、OM-H。2) 牡蠣酶解粉 (Oyster hydrolysis,OH) 的制備。參照李婉[18]的酶解工藝制備。其低、中、高劑量組分別命名為OH-L、OH-M、OH-H。

1.3.2 分組及給藥 小鼠適應性喂養1 周后，隨機分成每組10 只，所有小鼠自由飲水飲食，陽性對照組給藥維A 酸，模型組和空白組不灌胃，分組、照射及灌胃劑量見表1。

表1 分組、照射及灌胃劑量Table 1 Grouping,irradiation and intragastric dosage

1.3.3 小鼠皮膚光老化模型的建立 小鼠適應性喂養1 周后，使用脫毛刀將其背部絨毛剃凈，背部裸露面積為3 cm×4 cm，每日剃掉新長出的絨毛，保持背部皮膚始終暴露。采用LED 紫外燈 [紫外線強度：UVA (365 nm)=360 μW·cm?2和UVB (310 nm)=30 μW·cm?2]每日照射小鼠背部皮膚。正式實驗開始前測得最小紅斑量為117 mJ·cm?2，即照射5 min。第1 至第2 周照射最小紅斑量的一半 (2.5 min·d?1)，之后每2 周增加30 s，即第3 至第4 周3 min·d?1，第5 至第6 周3.5 min·d?1，第7 至第8 周4 min·d?1，共照射8 周，總照射劑量為4 258.8 mJ·cm?2。

1.3.4 指標評測 1) 皮膚表征評價。皮膚等級評分：小鼠二氧化碳(CO2)麻醉處死后，對其背部皮膚進行拍照和皮膚等級評分。皮膚皺紋等級評分標準的制定參照Kong 等[19]的評分標準，并加以改進(表2)；皮膚總厚度的測定：皮膚組織經過長期UV 照射后，會產生增生增厚的現象，主要表現為表皮層增厚和皮膚整體厚度增加。剪開小鼠背部皮膚后，在皮膚自然松弛的狀態下使用電子游標卡尺量取單層小鼠皮膚厚度 (mm)。提皮恢復時間測試：小鼠二氧化碳麻醉處死后，用食指和中指輕輕提起小鼠背部中軸線處皮膚，以四肢剛好接觸桌面為準，松手即開始計時，測量背部皮膚恢復至提皮前原始狀態的時間 (s)[20]。

表2 皮膚皺紋等級評分標準Table 2 Skin wrinkle rating scale

2) HE 染色、Masson 染色及醛品紅染色。組織石蠟包埋：采取小鼠同一處背部皮膚約0.5 cm×0.5 cm，立即浸泡于4%多聚甲醛組織固定液中，常溫固定72 h 后，采用常規方法脫水，按照皮膚縱向方向石蠟包埋。常規HE 染色：石蠟切片4 μm，蘇木精染細胞核，伊紅染細胞質。100 倍顯微鏡下觀察切片，每個切片隨機選取3 處測量皮膚表皮層厚度；Masson 染色：石蠟切片膠原纖維被苯胺藍染成藍色，顯微鏡下觀察膠原纖維分布情況；醛品紅染色：彈力纖維被染成紫色，背景呈黃色。顯微鏡下觀察彈性纖維的聚集情況。

3) 生化指標測定。取小鼠0.1 g 皮膚組織剪碎，加入9 倍體積的磷酸鹽緩沖液，pH 為7.2，使用手持組織研磨器置于冰上充分勻漿，3 600 r?min?1離心20 min，取上清液于4 ℃冷藏待測。通過檢測SOD、GSH-Px、MDA 和8-OHDG 水平評估皮膚抗氧化能力；通過檢測Hyp、MMP-3 和MMP-9 水平評估皮膚基質損傷情況；通過檢測IL-6、TGF-β和TNF-α 水平評估皮膚炎癥程度和自我修復能力。測量方法：測量前預實驗確定樣品稀釋濃度，最佳稀釋濃度的百分抑制率介于45%～50%，以此作為加樣濃度以獲得最佳線性關系，減小測量誤差。標準曲線和樣本的測量均參照試劑盒說明，當標準曲線R2>0.995，認為該次實驗有線性關系，將吸光值代入公式計算加樣測定指標的值。

1.4 數據統計分析

數據使用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，數據結果以“平均值±標準差 ()”表示，組間差異用樣本均數比較的LSD 檢驗，P<0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 牡蠣及其酶解產物對皮膚表征的影響

測得OM 蛋白質質量分數為605.2 g·kg?1，OH為603.2 g·kg?1。外源性皮膚老化80%是由紫外線長期照射引起，主要表現為皮膚松弛、皺紋加深并出現皮革樣的粗糙增厚，此類皮膚衰老也被稱為皮膚光老化[21]。與B 組相比，M 組小鼠的皮膚評分、提皮恢復時間和皮膚總厚度三項指標均顯著上升 (P<0.05，表3)，說明小鼠光老化皮膚造模成功。與M 組相比，OH-H 組皮膚評分、提皮恢復時間和皮膚總厚度均顯著下降 (P<0.05)；B 和P 組皮膚呈現光滑緊致的狀態；M 組背部橫向皺紋深且明顯；OM-H、OH-M 和OH-H 組皮膚較光滑，低、中劑量組皮膚出現輕微紅斑，這一現象在高劑量組消失 (圖1-a)。皮膚光老化后皮下血管的狀態具有雙向性變化，慢性光老化表現為血管萎縮，急性光損傷表現為血管擴張和血管通透性增加，導致血管附近炎癥反應加劇[22-23]。B 和P 組的血管清晰且分布呈樹枝狀，分支多且血管周圍無炎癥現象；M 組血管明顯萎縮且血管通透性增加、伴隨炎癥(圖1-b)；隨著OM 的劑量增加，小鼠皮下血管萎縮情況有所改善，但均有明顯的炎癥反應；隨著OH 的劑量增加，小鼠皮下血管萎縮情況和炎癥反應均有所改善，OH-H 組血管狀態接近B 組。綜上，OM 和OH 可減輕皮膚光老化產生的皺紋和炎癥，且均在光老化皮膚表征評價上表現出劑量依賴性，OM 的中、高劑量組在皮膚評分和提皮恢復時間上、OM 各劑量組的皮膚總厚度以及OH 各劑量組的組間差異均為顯著 (P<0.05)，同劑量下OH 的效果優于OM。

表3 皮膚表征評價Table 3 Evaluation of skin characterization ±SD

注：每列不同字母代表差異顯著 (P<0.05)Note:Different letters in the same column represent significant difference (P<0.05).

2.2 皮膚病理染色組織學分析

2.2.1 牡蠣及其酶解產物對皮膚結構和表皮層厚度的影響 皮膚長期經受UV 照射會導致皮膚表皮層增厚[24]，UVA 導致真皮層成纖維細胞變形和減少[25]。圖2-a 中B 組表皮層結構完整，表皮細胞排列緊密均勻，真皮組織呈波浪狀，真皮層成纖維細胞形態正常；與B 組相比，M 組表皮角化過度，細胞增大，真皮層細胞排列扭曲，細胞核變形，由于毛細血管通透性增加，組織間隙可見少量紅細胞，表現出典型的光老化癥狀；使用OM 和OH 治療后小鼠真皮層組織的紊亂變形現象減少，有效改善了表皮層角化過度現象，中高劑量組真皮層纖維細胞豐富，排列緊密，基本無變形。表皮層厚度結果見圖2-b，與B 組相比，M 組表皮層顯著增厚(P<0.05)，小鼠每日攝入180 mg?kg?1的OH 后，表皮層厚度相比M 組顯著下降 (P<0.05)，與B 組無顯著差異 (P>0.05)。攝入OM 后也具有同樣作用，但中、高劑量的OH 效果優于同劑量的OM。結果表明食用OH 后，真皮層細胞得到保護，細胞變形和凋亡的情況也有所減少，并能夠防止表皮角化過度。

圖2 牡蠣及其酶解產物對小鼠光老化皮膚結構和表皮層厚度的影響同一指標中標有不同字母代表差異顯著 (P<0.05)；圖4～圖6 同此Figure 2 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on the structure and thickness of photoaging skin in miceFor the same indicator,different letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in Figure 4?Figure 6.

2.2.2 牡蠣及其酶解產物對膠原纖維和彈力纖維的影響 UVA 會穿過表皮層作用于真皮層，導致皮膚成纖維細胞中的基質金屬蛋白酶 (MMPs) 表達增加，最高可達10 倍[26]。MMPs 的不同亞型作用于不同基質，幾種MMPs 協同作用可完全降解皮膚基質，導致不可逆的皮膚光老化。目前已知MMP-1作用于Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維，可幾乎完全裂解膠原纖維；MMP-3 可以廣泛作用于Ⅳ型膠原纖維、蛋白聚糖、纖維粘連蛋白和板層素膠原纖維；MMP-9可進一步降解MMP-1 所產生的膠原蛋白片段，使皮膚不能自主修復膠原蛋白結構，并使膠原纖維和彈性纖維減少、膠原合成降低、異常彈性纖維增生成束、細胞外基質消失斷裂，最終導致皮膚出現光老化癥狀[27-28]。M 組的膠原纖維呈現卷曲、排列混亂的狀態，彈力纖維在表皮層明顯增多、呈現大面積的紫色，且在真皮層聚集扭曲、增粗、分布不均。與M 組相比，OM 和OH 可減少光老化皮膚中的膠原排列卷曲紊亂和彈性纖維聚集增生的現象，隨著劑量的增加，小鼠皮膚中平行有序排列的膠原蛋白增多，膠原卷曲聚集的區域減少 (圖3-a)；表皮層被染成紫色的彈力纖維的增生程度降低，真皮層的彈力纖維呈網狀分布，聚集成束的區域減少(圖3-b)。以上結果表明OM 和OH 可以減輕皮膚中的膠原蛋白流失，降低皮膚表層的過度角化，保持膠原蛋白和彈性纖維呈網狀均勻分布，避免皮膚松弛。

圖3 牡蠣及其酶解產物對小鼠光老化皮膚中膠原纖維 (a) 和彈力纖維 (b) 的影響 (100×)圖3-a 中黑色箭頭指示混亂卷曲的膠原纖維，黃色箭頭指示排列規律的膠原纖維；圖3-b 中黑色箭頭指示彈力纖維在表皮層的異常增生Figure 3 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on collagen fibers (a) and elastic fibers (b) in photoaging skin of mice (100×)In Figure 3-a,the black arrows indicate the disorderly and curly collagen fibers,and the yellow arrows indicate the regularly arranged collagen fibers;in Figure 3-b,the black arrows indicate the abnormal proliferation of elastic fibers in the epidermis.

2.3 牡蠣及其酶解產物對皮膚抗氧化能力的影響

氧化應激是皮膚光老化的重要機制之一，UVB主要作用于表皮層和真皮層淺表，誘導細胞產生過量自由基 (ROS)，機體內的抗氧化酶不能夠及時將其消滅，多余的ROS 會攻擊細胞內的脫氧核糖核苷酸 (DNA)、蛋白質和脂質[29]，剝奪蛋白質、生物膜、DNA、RNA 等生物大分子的電子，導致蛋白質失活、細胞功能病變、DNA 扭曲變形和RNA轉錄障礙，對皮膚產生不可逆傷害；本研究通過檢驗DNA 的標志性氧化產物8-OHDG 和細胞膜脂質的過氧化產物MDA 來衡量皮膚氧化程度。自由基還會引起調控能量穩態的重要激酶AMPK 和核因子NF-κB 等信號通路異常，進而觸發其他光老化機制[30-31]。因此，研究皮膚中的幾種關鍵抗氧化酶的活性以及生物大分子的氧化產物，即可衡量OM和OH 對皮膚抗氧化能力的影響。小鼠皮膚中的抗氧化酶和氧化產物變化見圖4，與M 組相比，小鼠攝入OM 和OH 后，皮膚中的GSH-Px 表達量顯著增加，OH-M 和OH-H 組的SOD 活性較M 組顯著增加，MDA 顯著降低 (P<0.05)，但所有劑量組之間在MDA 含量上均無顯著差異 (P>0.05)。其中OH-H 組在保護DNA 方面表現優異，小鼠皮膚中的8-OHDG 顯著低于M 和B 組，差異具有統計學意義 (P<0.05)。結果表明，OM 和OH 能夠顯著提高光老化小鼠皮膚的抗氧化酶活力，保護細胞膜脂質和DNA 不受自由基攻擊，從而提升皮膚抑制由ROS 導致的氧化應激能力。

圖4 牡蠣及其酶解產物對超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化氫酶、丙二醛和8-羥基脫氧鳥苷的影響Figure 4 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on SOD,GSH-Px,MDA and 8-OHDG

2.4 牡蠣及其酶解產物對減輕皮膚基質損傷的影響

紫外線導致MMPs 活性增強，MMPs 協同作用于膠原纖維、彈性纖維和明膠等基質，最終導致皮膚產生皺紋和松弛。本研究中小鼠皮膚在Masson 染色中，OM 和OH 對皮膚中膠原蛋白和彈性纖維的有序排布產生了積極影響，因此本研究選取MMP-3 和MMP-9 以及膠原蛋白特有的羥脯胺酸 (Hyp) 進一步探究OM 和OH 對保護皮膚中膠原的作用途徑。與B 組相比，M 組的MMP-3 和MMP-9均增加 (P<0.05)，Hyp 降低 (P<0.05，圖5)。與M 組相比，小鼠攝入中、高劑量的OH 后，MMP-3的表達顯著降低，攝入中、高劑量的OM 和OH后，MMP-9 的表達降低 (P<0.05)。在攝入OH 和高劑量的OM 后，皮膚中Hyp 含量與B 組相比無顯著差異 (P>0.05)。Han 等[32]的研究表明，UVB照射的光老化小鼠服用牡蠣水解物可降低MMPs基因，同時增加I 型膠原和TIMP-1 基因表達。因此猜測對于UVA+UVB 導致的皮膚光老化，OH 具有相似的作用機制，OH 通過抑制MMPs 活性來減緩膠原蛋白分解，有效保護了皮膚中的膠原蛋白，結合小鼠背部皮膚的Masson 染色結果，猜測OH 能夠減少皮膚中膠原蛋白的扭曲變形[33]。

圖5 牡蠣及其酶解產物對MMP-3 (a)、MMP-9 (b)和羥脯胺酸 (c) 的影響Figure 5 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on MMP-3 (a),MMP-9 (b) and Hyp (c)

2.5 牡蠣及其酶解產物對光老化皮膚組織中炎癥反應的影響

紫外線刺激皮膚產生的大量ROS 和TNF-α，可激活MAPK 途徑中的蛋白激酶和磷酸酶，導致c-Jun 和c-Fos 蛋白的表達增加，最終形成AP-1 和NF-κB，而NF-κB 調節許多促炎細胞因子，具有代表性的則是成纖維細胞分泌的IL-6，可導致細胞毛細血管的通透性增加、中性粒細胞和其他吞噬細胞浸潤和激活，最終引發皮膚紅斑等急性炎癥損傷[34]。與TNF-α 相反的是TGF-β 可促進前膠原基因轉錄，起到抗炎作用[35]。本研究選取IL-6、TNF-α和TGF-β 衡量皮膚炎癥反應程度。皮膚光老化小鼠攝入OM 和OH 后，皮膚中的IL-6 水平有所降低，OM-H、OH-M、OH-H 組TNF-α 水平降低 (P<0.05)，代表NF-κB 調節炎癥反映途徑受到阻礙，在增強TGF-β 表達方面，OH-M 組最顯著 (P<0.05)。在攝入高劑量的牡蠣酶解物后，TNF-α 水平顯著低于B 組 (P<0.05，圖6)。結果表明OM 和OH 可降低皮膚中炎癥因子的表達，切斷I L-6 激活AMPK 通路，從而降低MMP-1 的表達。牡蠣酶解物通過提高TGF-β 水平提升皮膚的抗炎能力，結合小鼠皮下組織血管分布圖，和小鼠背部圖中皮膚紅斑的形成程度，發現OH 通過降低促炎因子表達和降低MMPs 表達2 種途徑實現抗皮膚光老化的作用。

圖6 牡蠣及其酶解產物對白介素6、腫瘤壞死因子α (b) 和轉化生長因子β (c) 的影響Figure 6 Effect of oysters and their enzymatic hydrolysis products on IL-6 (a),TNF-α (b) and TGF-β (c)

3 結論

本研究通過模擬自然光比例的UVA+UVB 每天照射構建小鼠皮膚光老化模型探究牡蠣的抗光老化活性。結果表明，OM 和OH 能夠使光老化皮膚的皺紋減輕、防止皮膚呈皮革樣增厚、增加皮膚彈性、保護皮膚中的膠原蛋白的網狀排列、避免彈性纖維在表皮的異常增生，并能夠改善皮下毛細血管萎縮和通透性增加。參考光老化機理相關的研究[36]，總結OM 和OH 的3 種抗皮膚光老化途徑：1) 顯著提高皮膚中抗氧化酶的活力、保護皮膚組織中的細胞膜脂質和DNA 不被氧化；2) 抑制基質金屬蛋白酶的表達 (MMP-3、MMP-9)，保護真皮膠原蛋白 (Hyp)；3) 高劑量的OH 可顯著降低皮膚中炎癥因子的表達 (IL-6 和TNF-α)，并提高皮膚的抗炎能力 (TGF-β)。OM 和OH 均在抗光老化活性上表現出劑量依賴性，OH 的抗光老化效果更顯著。雖然實驗數據證實OH 具有抗光老化活性，但牡蠣主要以藻類為食，已經有大量文獻證實海藻多糖具有良好的抗氧化活性[37-38]，而ROS 學說作為光老化機制中的一條重要通路，難免會將牡蠣內臟團中藻類多糖的抗氧化活性與之聯系起來。因此，需要對牡蠣酶解物中的多肽、多糖進一步分離純化，進行更詳細的研究。