扁吻魚胚胎發(fā)育及仔稚魚形態(tài)與生長觀察研究

韓軍軍，賀疆滔，陳 朋，胡江偉，祁 峰，封永輝，蔡林鋼，時春明，張人銘

（新疆維吾爾自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，新疆 烏魯木齊 830000）

扁吻魚 (Aspiorhynchus laticeps) 俗稱新疆大頭魚，體長、頭大、吻扁、眼小，生長緩慢，隸屬于硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、扁吻魚屬。扁吻魚1 屬1 種，是我國塔里木河水系特有的肉食魚類，主要以塔里木裂腹魚 (Schizothorax biddulphi)、草魚 (Ctenopharyngodon idella)、鯉 (Cyprinus carpio)等為食[1]。由于過度捕撈和環(huán)境破壞，野生扁吻魚數(shù)量急劇減少，1998 年被列為國家Ⅰ類保護(hù)水生野生動物，被稱為“水中大熊貓”和“古魚類活化石”，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和科研價值[2]。根據(jù)馬燕武等[3]的調(diào)查研究，扁吻魚野生資源急劇減少，棲息地和產(chǎn)卵場的破壞使野生種群難以得到補(bǔ)充。因此，開展扁吻魚的人工繁育必不可少，通過人工孵化技術(shù)可以顯著提高魚類的繁殖能力，并取得巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益[4]。在開展人工繁育時，魚類早期生活史研究是魚類自然資源繁殖保護(hù)和養(yǎng)殖業(yè)苗種培育的基礎(chǔ)[5]，本研究在人工培育條件下觀察扁吻魚胚胎發(fā)育過程、仔稚魚形態(tài)變化與生長特性，旨在了解其早期生長和發(fā)育情況，為今后苗種培育奠定理論基礎(chǔ)，在實現(xiàn)扁吻魚野生資源恢復(fù)及提供技術(shù)支撐方面，具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料選用新疆水生野生動物救護(hù)中心全人工養(yǎng)殖的子一代扁吻魚作為繁殖親本。親本養(yǎng)殖在圓形PE 桶內(nèi) (直徑2.2 m，高0.8 m)，每天09:00、13:00、17:00 各投喂1 次，PE 桶每隔15 d 清洗并換水1 次。根據(jù)親本的性成熟程度選取成熟度好的魚體用于繁殖，其中雌魚9 尾，質(zhì)量 (4.22±0.37) kg，雄魚6 尾，質(zhì)量 (2.12±0.13) kg，雌雄配比為3∶2。扁吻魚繁殖期為四月中旬，水溫 (16.27±0.41) ℃，pH 7.3±0.23，溶解氧質(zhì)量濃度為 (9.85±0.43) mg·L?1。

1.2 人工催產(chǎn)和孵化

扁吻魚孵化采用人工催產(chǎn)，催產(chǎn)藥物是促黃體生成素釋放激素類似物 (LRH-A2，0.125 mg，寧波第二激素廠) 和馬來酸地歐酮 (DOM，100 mg，寧波三生生物科技有限公司)，雌魚每千克注射LRHA22 μg，DOM 2 mg，雄魚劑量減半，間隔24 h 注射1 次，雌魚注射3 次，雄魚注射1 次。采用人工干法受精，首先將魚體用2-苯氧乙醇 (2-phenoxyethanol，2.5 kg，德國巴斯夫) 進(jìn)行麻醉，撈出后魚體表面用吸水紙擦干，用毛巾固定魚體，輕輕拍打魚腹，手從前向后擠壓。將卵和精液先后擠入干燥塑料盆內(nèi)，用羽毛順時針混勻后加入少量清水?dāng)嚢? min，使魚卵充分受精。隨后用清水漂洗3 次，去除卵表面黏性和雜質(zhì)。脫黏完成后加入清水并靜置30 min，使受精卵充分吸水膨脹，隨后將受精卵轉(zhuǎn)至孵化框 (100 cm×60 cm) 上，孵化框放置于孵化槽中部 (420 cm×80 cm×49 cm)，每個孵化槽放置3 塊孵化框，每個孵化框?qū)蔷€兩端放入氣石，通過調(diào)節(jié)出氣量大小保證受精卵供氧充足，隔天將死卵用吸管吸出。

1.3 受精卵和仔魚的觀察與培育

受精成功后，隨機(jī)選取90 粒受精卵用于顯微觀察。受精卵各個時期的形態(tài)特征和仔魚發(fā)育的形態(tài)變化通過SDPTOP 顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。扁吻魚受精卵發(fā)育初2 h 內(nèi)，連續(xù)觀察，隨后每2 h觀察1 次。胚胎發(fā)育階段的劃分以50%以上樣本進(jìn)入該階段來確定[6]。仔魚孵出后，每4 h 觀察1 次，觀察仔魚的不同發(fā)育階段特征，仔魚發(fā)育階段的劃分參照龔小玲等[7]。測量卵和仔稚魚的長度，計算受精率和孵化率。仔魚上浮可攝食后，投喂鹵蟲無節(jié)幼體，投喂時間09:00 和17:00。以臺微尺為參照物配合圖像處理軟件 (Adobe Photoshop CC 2015)對受精卵的卵徑和仔魚全長等進(jìn)行測量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

胚胎發(fā)育過程的有效積溫推算[6]：

其中K為有效積溫，N為發(fā)育所需時間，T為該發(fā)育階段的平均水溫。

卵黃囊體積 (V) 計算公式[6]：

其中L為卵黃囊長徑，D為短徑。

特定生長率 (Specific growth rate,SGR) 計算公式[8]：

其中t1、t2為日齡，LT1、LT2分別為t1、t2時的全長。

采用Excel 2007 和Adobe Photoshop CC 2015 整理實驗數(shù)據(jù)并統(tǒng)計作圖。SPSS Statistics 23.0 軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (Oneway ANOVA)，差異顯著水平設(shè)置為P<0.05，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示。

2 結(jié)果

2.1 受精卵的發(fā)育

扁吻魚成熟卵呈橢圓球形，青灰色不透明，微黏，沉性卵。成熟卵卵徑 (2.46±0.13) mm。受精吸水后迅速膨脹，吸水后卵徑了 (3.42±0.15) mm，較吸水前增大了39.02%。吸水后受精卵和未受精卵顏色變淡，卵周隙增大。受精成功的卵細(xì)胞開始胚胎發(fā)育，部分未受精的成熟卵在吸水膨脹后會卵裂，但多數(shù)發(fā)育至多細(xì)胞期死亡，少數(shù)可發(fā)育至囊胚期。

圖1 扁吻魚胚胎發(fā)育a.成熟卵；b.受精卵；c.1 細(xì)胞期；d.2 細(xì)胞期；e.4 細(xì)胞期；f.8 細(xì)胞期；g.16 細(xì)胞期；h.桑葚期；i.囊胚早期；j.囊胚中期；k.囊胚晚期；l.原腸早期；m.原腸中期；n.原腸晚期；o.神經(jīng)胚期；p.胚孔閉合期；q.視囊出現(xiàn)期；r.肌肉效應(yīng)期；s.耳石形成期；t.孵化前期Figure 1 Embryonic development of A.laticepsa.Mature egg;b.Fertilized egg;c.1-cell stage;d.2-cell stage;e.4-cell stage;f.8-cell stage;g.16-cell stage;h.Morula stage;i.Early blastula stage;j.Middle blastula stage;k.Late blastula stage;l.Early gastrula stage;m.Mid-gastrula stage;n.Late gastrula stage;o.Neurula stage;p.Blastopore closed stage;q.Optic capsule stage;r.Muscular effect stage;s.Otolith formation stage;t.Prehatching stage

受精卵吸水膨脹后，卵黃收縮下沉到卵內(nèi)下部，原生質(zhì)向動物極移動，隆起形成胚盤 (圖1-a～c)。卵裂階段發(fā)展迅速，形成后35 min，胚盤表面形成分裂溝，胚盤分裂成2 個大小相等的分裂球(圖1-d)。受精110 min 后開始第二次分裂，分裂方向與第一次分裂垂直，進(jìn)入4 細(xì)胞期 (圖1-e)。第三次分裂形成2 條分裂溝，與第一次分裂平行，形成8 個大小基本相等的分裂球 (圖1-f)。受精卵分裂形成16 個分裂球后分裂球越分越小 (圖1-g)，個體差異變大且分裂細(xì)胞開始不規(guī)則排列，但細(xì)胞界限仍然可見 (圖1-h)。細(xì)胞界限模糊后形成高囊胚，進(jìn)入囊胚早期 (圖1-i)。囊胚中期時囊胚高度下降，胚層變薄，直至形成胚環(huán) (圖1-j～k)。原腸期可分為原腸早期、原腸中期和原腸晚期。從原腸早期囊胚細(xì)胞開始下包，到原腸晚期時胚層下包4/5 (圖1-l～n)。原腸晚期后胚盤頂部逐漸隆起腫大，腦泡開始形成，神經(jīng)板和卵黃栓出現(xiàn) (圖1-o～p)。胚孔封閉后胚體出現(xiàn)肌節(jié)，在腦兩側(cè)出現(xiàn)與體軸平行的長圓形泡，即眼的原基 (圖1-q)。頭部進(jìn)一步分化，胚體出現(xiàn)不規(guī)律收縮，肌節(jié)增加，尾部末端尾鰭褶出現(xiàn)，胚體開始在膜內(nèi)扭動，平均(20.42±2.84)次·min?1，兩側(cè)聽囊內(nèi)出現(xiàn)一對透明的圓點，即耳石 (圖1-r～s)。受精44.33 h 后胚體尾尖已彎至眼部，心臟開始搏動，胚體在膜內(nèi)不停扭動，直至出膜 (圖1-t)。根據(jù)胚胎發(fā)育的外部形態(tài)和典型特征將其分為受精卵、胚盤形成、卵裂、囊胚、原腸、神經(jīng)胚、器官分化和孵化共8 個階段，整個胚胎發(fā)育耗時115.72 h，所需積溫為3 765.42 ℃·h，其中器官形成階段耗時最長 (47.67 h)，積溫775.54 ℃·h。各發(fā)育階段耗時和積溫詳見表1。

表1 扁吻魚胚胎發(fā)育時序Table 1 Process of embryonic development of A.laticeps

2.2 仔稚魚的發(fā)育

根據(jù)扁吻魚仔稚魚的外部形態(tài)變化和器官形成，將仔稚魚分為仔魚前期、仔魚后期和稚魚期3 個階段。初孵仔魚卵黃囊前部呈橢圓形，后部為長棒狀，體積為 (6.10±0.19) mm3。卵黃在仔魚孵化后9 d 內(nèi)消耗完畢，其中前3 d 吸收最快，3 d 內(nèi)卵黃消耗75.57%，隨后趨于平緩。仔魚在出膜后第7 天開始攝食，進(jìn)入混合營養(yǎng)期。扁吻魚仔魚卵黃囊的平均體積與孵化后的天數(shù)關(guān)系見圖2。

圖2 扁吻魚仔魚卵黃囊體積與出膜天數(shù)的關(guān)系Figure 2 Relationship between yolk sac volume and days of hatching of A.laticeps

初孵仔魚全長 (7.58±0.31) mm，通體透明，脊索略彎曲，心臟位于卵黃囊前方，可觀察到明顯心跳，有無色血液流動，眼無黑色素沉積，初孵仔魚一般側(cè)臥水體，可通過魚尾擺動平游 (圖3-a)。2 d 后仔魚全長 (8.53±0.36) mm，卵黃囊被進(jìn)一步吸收，晶體顏色加深，血液顏色加深，心跳頻率(53.60±5.00) 次·min?1，能明顯觀察到紅色血液流動軌跡，仔魚的頭部出現(xiàn)星狀色素，口能活動 (圖3-b)。5 d 后仔魚全長 (9.34±0.23) mm，胸鰭出現(xiàn)，星狀色素已經(jīng)遍布魚體，眼球色素明顯增多。7 d 后腸道內(nèi)可見明顯食物殘留，體色加深，尾椎骨上翹明顯，仔魚全長 (9.72±0.14) mm。卵黃在9 d 后吸收完畢，魚鰾清晰可見，鰓蓋可見節(jié)律性地張開，仔魚全長 (10.50±0.21) mm (圖3-c)。仔魚前期全長特定生長率為 (3.63±0.68)%，前期仔魚在前3 d 魚體全長增長較快，第4 天到第7 天較為平緩，隨后增大 (圖4)。前7 d 變化趨勢與卵黃囊消耗速率一致，7 d 后速度增大是由于仔魚開始開口攝食。

圖3 扁吻魚仔稚魚發(fā)育a.初孵仔魚；b.出膜2 d；c.出膜9 d；d.出膜26 d；e.出膜45 d；f.出膜86 d；g.1 齡幼魚；h.2 齡幼魚Figure 3 Delopment of A.laticeps larva and juvenilea.Newly hatched larva;b.2 d post hatching;c.9 d post hatching;d.26 d post hatching;e.45 d post hatching;f.86 d post hatching;g.yearling;h.Two-year-old of young fish

圖4 扁吻魚前期仔魚全長Figure 4 Total length of A.laticeps prelarva

仔魚后期，卵黃已被完全吸收，仔魚進(jìn)入外源性營養(yǎng)階段，整個仔魚后期歷時36 d。仔魚在出膜26 d 后全長 (19.86±0.55) mm，頭部色素斑塊密集，鰓蓋不透明，各鰭條上出現(xiàn)色斑，尾鰭未分叉(圖3-d)。45 d 時各鰭條已發(fā)育完全，魚體整體呈黃色，背部遍布色素斑點，側(cè)線明顯，魚體全長(37.10±0.45) mm (圖3-e)。仔魚后期全長特定生長率為 (3.51±2.10)%。

稚魚鱗片首先出現(xiàn)側(cè)線鱗，隨后在鰓蓋后緣側(cè)線上下、背鰭基部發(fā)現(xiàn)鱗片，以鰓蓋后緣和背鰭基部為中心向四周延伸和覆蓋。出膜第86 天時稚魚全長 (79.67±0.48) mm，體質(zhì)量 (3.56±0.28) g，此時側(cè)線鱗上方鱗片覆蓋完成，側(cè)線鱗下方尾柄基部鱗片覆蓋基本完成 (圖3-f)。整個稚魚期歷時63 d，全長特定生長率為 (1.32±0.17)%，魚類體型接近成魚，但體色和身體斑紋與成魚存在差異。仔魚后期、稚魚期魚體全長變化見圖5，稚魚期末時魚體全長是初孵仔魚的11.26 倍。

圖5 后期仔魚、稚魚全長Figure 5 Total length of A.laticeps postlarva and juvenile

2.3 扁吻魚人工催產(chǎn)時間、孵化和培育效果

本研究共采卵21.45×104粒，受精率88.95%，孵化率93.27%，采卵后親魚未出現(xiàn)死亡，孵化出的魚苗身體健康，游動活潑，轉(zhuǎn)入池塘后經(jīng)過1 年培育，幼魚魚體平均全長 (15.71±0.89) cm，體質(zhì)量(28.29±6.15) g，體型和體色與成魚接近 (圖3-g)。2 齡幼魚 (5.83±3.58) cm，體質(zhì)量 (132.15±50.80) g，幼魚生長正常，體型和體色已與成魚無異 (圖3-h)。

3 討論

3.1 扁吻魚與其他裂腹魚類卵細(xì)胞顏色差異分析

扁吻魚卵細(xì)胞呈青灰色，與經(jīng)過人工養(yǎng)殖的塔里木裂腹魚卵色一致[9]，齊口裂腹魚(Sclizothorax prenanti)[10]、斑重唇魚 (Diptychus maculates)[11]、光唇裂腹魚 (S.lissolabiatus)[12]和拉薩裸裂尻魚(Schizopygopsis younghusbandi)[13]的卵呈金黃色，短須裂腹魚 (S.wangchiachii)[14]、長絲裂腹魚 (S.dolichonema)[15]、小裂腹魚 (S.parvus)[16]、雙須葉須魚 (Ptychobarbus dipogon)[17]和異齒裂腹魚 (S.o'connori)[18]的卵為淡黃色，尖裸鯉 (Oxygymnocypris stewartii) 的卵為黃色，拉薩裂腹魚(S.waltoni)的卵為棕色[13](表2)。綜上，不同裂腹魚的卵色存在差異，而且不同環(huán)境下同種裂腹魚類的卵色也會發(fā)生變化。謝春剛等[9]在對塔里木裂腹魚進(jìn)行繁殖時發(fā)現(xiàn)兩個不同地區(qū)親本產(chǎn)的卵顏色不同，任波等[19]在2005 年對克孜爾水庫野生扁吻魚進(jìn)行觀察時發(fā)現(xiàn)魚卵為淡黃色，2006 年捕獲野生親本產(chǎn)卵顏色為淺灰色[20]。張人銘等[21]觀察卵顏色是青灰色，與本研究一致。以往研究采用的扁吻魚野生親本均捕獲自渭干河，任波等捕獲野生扁吻魚后直接進(jìn)行觀察和研究，張人銘等則是將親魚轉(zhuǎn)運至阿克蘇養(yǎng)殖在池塘中馴化成熟后進(jìn)行人工催產(chǎn)，魚類的生存環(huán)境、食物組成發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致卵的顏色發(fā)生變化。任波等2005、2006 年在克孜爾水庫的捕獲的野生扁吻魚卵的顏色也存在差異[19-20]，這表明扁吻魚的卵色變化不僅受生存環(huán)境和食物的影響，還可能存在造成其卵色差異的其他因素。

表2 其他裂腹魚類發(fā)育特點比較Table 2 Comparison of developmental characteristics between other Schizothoracinaes

3.2 扁吻魚胚胎、仔稚魚發(fā)育特征

扁吻魚孵化水溫 (16.27±0.41) ℃，高于斑重唇魚和長絲裂腹魚，與塔里木裂腹魚、齊口裂腹魚、光唇裂腹魚、短須裂腹魚等相近。扁吻魚成熟卵卵徑 (2.46±0.13) mm，大于塔里木裂腹魚、光唇裂腹魚和小裂腹魚，小于齊口裂腹魚、短須裂腹魚和長絲裂腹魚，與重口裂腹魚 (S.davidi)[22]、尖裸鯉、拉薩裸裂尻魚和異齒裂腹魚相近 (表2)。吸水后受精卵迅速膨脹，卵徑 (3.42±0.15) mm，較吸水前增大了39.02%，低于塔里木裂腹魚 (58.82%)、長絲裂腹魚 (44.2%)、光唇裂腹魚 (45.45%)、小裂腹魚(57.89%)和異齒裂腹魚 (52.91%)，與齊口裂腹魚(40%) 和拉薩裂腹魚 (36.61%) 相近，高于短須裂腹魚 (27.40%)、尖裸鯉 (25.29%) 和拉薩裸裂尻魚(25.29%)。而且在以往研究中，獲取的扁吻魚受精卵卵徑介于1.5～1.85 mm[20-21]，小于本研究。魚類卵徑大小因物種不同存在差異，同種間因親魚不同、環(huán)境變化及產(chǎn)卵時間不同，卵細(xì)胞大小也有差異[23-24]。本研究采用的扁吻魚親魚為全人工繁殖的子一代，養(yǎng)殖地點在昌吉，而之前研究則是選取渭干河流域 (阿克蘇地區(qū)) 的野生扁吻魚作為親本，推測環(huán)境變化和親本差異是扁吻魚卵徑變化的主要原因。裂腹魚類一般為沉性卵，受精卵吸水膨脹后體積擴(kuò)大，密度減小，在靜水中卵沉在水底，有一定水流時可隨流漂浮流動，從而提高受精卵成活率，保證幼魚發(fā)育[25]。

扁吻魚初孵仔魚長度 (7.91±0.31) mm，大于斑重唇魚，小于短須裂腹魚、長絲裂腹魚和重口裂腹魚，與塔里木裂腹魚和光唇裂腹魚相近。仔魚在開口攝食前發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)由卵黃提供[26]。不同裂腹魚類卵黃吸收時間存在差異，如塔里木裂腹魚卵黃吸收時間為8 d，重口裂腹魚為17 d，拉薩裂腹魚為23 d[27]，短須裂腹魚和扁吻魚為9 d。扁吻魚仔魚前期存在混合營養(yǎng)期，時間為2 d，短于重口裂腹魚的4 d、短須裂腹魚的3 d。混合營養(yǎng)期是仔魚從內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)的過渡階段，是魚類早期發(fā)育的一個重要階段[28]。重口裂腹魚繁殖月份為8—9 月，短須裂腹魚的為2 月，此時水體中浮游動物豐度低，仔魚需要較長的混合營養(yǎng)期來適應(yīng)餌料生物匱乏的不利環(huán)境[28-29]。扁吻魚繁殖月份為4 月中下旬，此時水溫逐漸升高，水中餌料生物較為豐富，可滿足其仔魚的攝食需求。

3.3 扁吻魚仔稚魚生長速率

仔魚前期歷時9 d，其中前3 d 生長速度快，3 d 內(nèi)卵黃消耗75.57%，說明在仔魚初孵時期卵黃作為營養(yǎng)物質(zhì)主要用于仔魚身體的快速生長，第4 至第7 天仔魚生長速度降低，卵黃消耗低，營養(yǎng)主要用于消化系統(tǒng)等器官的生長，第7 天后仔魚開始攝食，進(jìn)入混合營養(yǎng)階段，生長速度加快，仔魚前期全長特定生長率為 (3.63±0.68)%。仔魚后期歷時36 d，全長特定生長率為 (3.51±2.10)%。稚魚期歷時63 d，全長特定生長率為 (1.32±0.17)%。仔魚前期和仔魚后期全長特定生長率無顯著差異 (P>0.05)，稚魚期顯著低于仔魚前期、仔魚后期 (P<0.05)，這與華鳊 (Sinibrama taeniatus)[8]、短須裂腹魚[30]仔稚魚全長特定生長率變化趨勢基本一致。