克拉霉素及其雜質KL和KO的電噴霧串聯質譜分析

蔣可志，金 勇，王兆剛，付君平，秦欣榮，侯仲軻，潘遠江

(1.浙江大學化學系，浙江 杭州 310007；2. 浙江國邦藥業有限公司，浙江 紹興 312369)

克拉霉素又稱6-O-甲基紅霉素A，學名為5-(4-二甲胺四氫-3-羥基-6-甲基-2-吡喃氧基)-6-甲氧基-11,12,13-三羥基-2,4,6,8,10,12-六甲基-9-氧代-3-(四氫-5-羥基-4-甲氧基-4,6-二甲基-2-吡喃氧基)十五烷酸-μ-內酯，屬于14元環大環內酯類抗生素[1-2]。克拉霉素適用于鼻咽感染、下呼吸道感染、皮膚軟組織感染、急性中耳炎、肺炎、尿道炎及宮頸炎等感染癥狀的治療，對鏈球菌屬、肺炎球菌、葡萄球菌等革蘭陽性菌的抗菌作用略優于紅霉素，對誘導產生的紅霉素耐藥菌株也具有一定的抗菌活性[3-5]。

克拉霉素屬于微生物類次級代謝產物衍生物，其存在大量雜質，即使是全球最大的大環內酯類原料藥生產商(浙江國邦藥業有限公司)所生產的克拉霉素藥品也存在需進一步分析個別微量雜質結構。電噴霧串聯質譜技術具有快速、靈敏以及直接分析混合物等優點，在雜質結構分析中受到重視[6-8]。

本工作擬對克拉霉素及其雜質KL和KO進行電噴霧串聯質譜研究，總結質譜碎裂規律，以期為相關的雜質結構推導提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 1260系列高效液相色譜儀：美國Agilent公司產品；micro TOF-QII電噴霧四極桿-飛行時間質譜儀：德國Bruker公司產品。

1.2 樣品和試劑

克拉霉素(K)及其雜質KL、KO：浙江國邦藥業有限公司產品，化學結構示于圖1。甲醇、甲酸：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產品；水為去離子水，電阻率大于18.2 MΩ·cm；用于準確質量校正的PEG1000溶液由本實驗室制備。

圖1 克拉霉素(a)及其雜質KL(b)、KO(c)的結構式Fig.1 Structures of clarithromycin (a) and its impurities KL (b), KO (c)

1.3 實驗條件

使用甲醇-水溶液(1∶1，V/V)將待測物溶解并稀釋至10 mg/L，通過注射泵以3 μL/min注入電噴霧離子源，在正離子模式下離子化，以PEG1000為外標溶液對儀器進行準確質量軸校正。儀器操作參數：霧化氣為氮氣，壓力20 kPa；干燥氣為氮氣，流速2 L/min；干燥氣溫度250 ℃；毛細管電壓-4.5 kV；在二級質譜實驗中，碰撞氣體為氬氣，目標離子的質量選擇窗口4 u，碰撞誘導解離(CID)碰撞能量18 eV。使用Analysis version 4 軟件進行數據處理。

1.4 量化計算

量化計算軟件為Gaussian 03程序[9]，采用半經驗理論MP3基組進行結構優化和頻率計算。完成結構優化后，進行反應物、中間物和產物的結構頻率計算時不存在虛頻；而過渡態結構存在唯一的振動虛頻和合理的振動模式，并且通過內稟反應坐標(IRC)計算確認。本工作研究對象的結構非常復雜，存在許多構象，為獲得相對最優結構，采用分子動力學軟件對某一優化結構進行動力學模擬，獲得若干個初始優化結構，并將能量最低的結構作為相對最優結構。本文采用電子和熱自由能的總和進行能量討論，所優化的結構由Gaussview軟件(3.09版本)顯示。

2 結果與討論

2.1 克拉霉素的質譜碎裂研究

克拉霉素原樣的液相色譜圖示于圖2，K及其雜質KL和KO的出峰時間分別為12.71、9.92、17.17 min。經ESI電離，K、KL和KO均容易產生[M+H]+，即m/z748.484 2、763.494 1、777.510 0，確定其化學式分別為C38H70NO13+、C38H71N2O13+和C39H73N2O13+。采用高分辨Q-TOF技術對[M+H]+離子進行二級質譜分析，結果示于圖3，相關離子的質荷比、豐度以及元素組成等信息列于表1。

以K為例解析質譜碎裂規律?？死顾刭|子化離子的質譜碎裂類似于多肽的流動質子模式碎裂，帶電質子可以在其柔性結構中各堿性位點間遷移，當帶電質子遷移到解離質子化位點時，會誘導相應的碎裂反應[10-12]?？死顾亟Y構中存在許多堿性位點，包括氨基N、羰基O、醚鍵O和羥基O。其中，氨基N和羰基O的氣相堿度明顯大于醚鍵O和羥基O，量化計算結果示于圖4。克拉霉素氨基N質子化所形成的離子K5c的自由能比酮羰基O質子化離子K1和酯羰基O質子化離子K9的自由能分別低41.8、51.6 kJ/mol，表明克拉霉素的最優質子化位點在氨基N上。因此，克拉霉素經ESI電離后，帶電質子主要結合在氨基N上，形成質子化離子K5c。經碰撞活化后，克拉霉素質子化離子中帶電質子開始從氨基N向各解離質子化位點遷移，并引發相應碎裂。

圖2 克拉霉素原樣的液相色譜圖Fig.2 HPLC spectrum of the raw clarithromycin sample

注：碰撞能量18 eV圖3 克拉霉素(a)及其雜質KL(b)、KO(c)的[M+H]+離子高分辨串聯質譜圖Fig.3 Accurate MS/MS spectra of clarithromycin (a) and its impurities KL (b) and KO (c)

開環碎裂至少涉及2個化學鍵的斷裂，克拉霉素的大環內脂骨架上只有1個解離質子化位點(O原子)，故其不容易發生骨架開環碎裂，質譜碎裂優先發生在側鏈上，如大環骨架的6、5、3號位上的醚鍵O。

由于帶電質子主要結合在大環骨架5號位吡喃環的氨基N上，故先從5號位側鏈基團碎裂入手研究克拉霉素質子化離子K5c的碎裂規律?？死顾毓羌苌?號位側鏈脫氧氨基糖苷基團的質譜斷裂存在2種途徑，示于圖5。在path-1中，K5c克服93.9 kJ/mol的能壘使其帶電質子從氨基N遷移到5a位O原子上，形成異構離子K5a，同時自由能增加82.2 kJ/mol。K5a只需跨越6 kJ/mol的能壘就可以發生i-斷裂，并通過丟失大環內酯單元產生含吡喃環結構的碎片離子K5a-P(m/z158.1)。在path-2中，K5c需克服106.6 kJ/mol的能壘使帶電質子遷移到5b位O原子上，形成異構離子K5b，同時自由能增加94.6 kJ/mol。K5b繼續克服17.2 kJ/mol的能壘發生電荷誘導的C—O鍵斷裂，從而產生異構離子K5b2。K5b2繼續克服54.9 kJ/mol的能壘發生i-斷裂，引發脫氧氨基糖苷單元開環反應，產生亞胺結構碎片離子K5b-P(m/z116.1)，克拉霉素大環5號側鏈質譜碎裂的反應勢能面示于圖6。Path-1碎裂途徑的累積能壘為93.9 kJ/mol，遠小于path-2的159.8 kJ/mol，表明path-1碎裂途徑更易發生，即碎片離子K5a-P豐度為100%，而K5b-P豐度僅為9.6%，與表1的實驗結果相符合。

克拉霉素及其雜質大環6號側鏈發生的質譜碎裂途徑示于圖7。當帶電質子遷移到6a位的O原子上，形成異構離子K6a。K6a發生電荷誘導的丟失甲醇反應，產生碎片離子m/z716.5，其途徑為：1) 直接丟失形成碎片離子K6a-P1；2) 鄰基參與反應，即5號位上吡喃環的鄰位羥基親核進攻6號位C發生閉環反應并丟失甲醇分子，產生碎片離子K6a-P2。在K6a-P1離子結構中，正電荷定域在6號C上，而在K6a-P2離子結構中，正電荷以帶電質子的形式遷移到堿性位點上，其自由能比K6a-P1克拉霉素及其雜質大環發生在3號側鏈上的質譜碎裂途徑示于圖8。當帶電質子遷移到3a位O原子上，形成異構離子K3a，存在2種碎裂途徑：1) 5號位側鏈糖基上的羥基O5d原子親核進攻K3a的3號位側鏈糖基C3b原子，并發生O3a—C3b鍵斷裂，從而實現了3號位側鏈上糖基基團的遷移，形成異構體K3a2，K3a2上的帶電質子遷移到O5a原子后發生i-斷裂，通過丟失大環內酯單元產生碎片離子K3a-1P(m/z316.2)；2) 3號位側鏈糖基上的對位羥基O3c原子親核進攻C3b原子，發生O3a—C3b鍵斷裂，產生離子-中性復合物K-INC，其是由丟失3號側鏈糖基的克拉霉素(K3a-2P)與帶雙環結構的脫水吡喃糖類質子化離子(3P)兩部分組成。K3a-2P結構中含有叔胺N，其質子親和勢高于3P，所以在K-INC分離之前，3P的帶電質子遷移到K3a-2P的叔胺N上，然后產生碎片離子K3a-2P(m/z590.4)。K3a-2P與K5c結構相似，也能發生丟失甲醇的碎裂反應，產生碎片離子K3a-2P-P(m/z558.4)。

表1 克拉霉素及其雜質的高分辨串聯質譜圖中碎片離子信息Table 1 Accurate MS/MS data of clarithromycin and its impurities KL and KO

圖4 克拉霉素氨基N(a)和酮羰基O(b)、酯羰基O(c)質子化離子的優化結構Fig.4 Optimized structures of the N-protonated and the carbonyl O-protonated clarithromycin

圖5 克拉霉素及其雜質大環5號側鏈發生的質譜碎裂途徑Fig.5 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.5 side chain group

圖6 克拉霉素大環5號側鏈質譜碎裂的反應勢能面Fig.6 Potential energy surface for fragmentation of protonated clarithromycin at the No.5 side chain group

圖7 克拉霉素及其雜質大環6號側鏈發生的質譜碎裂途徑Fig.7 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.6 side chain group

圖8 克拉霉素及其雜質大環3號側鏈發生的質譜碎裂途徑Fig.8 Fragmentation pathways of protonated K, KL and KO at the No.3 side chain group

2.2 克拉霉素雜質KL和KO的質譜碎裂反應

雜質KL和KO是克拉霉素分別與羥胺或甲氧基胺縮合反應產生的，二者與克拉霉素具有非常相似的碎裂途徑：在高質量區存在相同的特征中性丟失，如丟失CH4O(32 u)、C8H12O3(158 u)、(C8H12O3+CH4O)(190 u)；在低質量區存在相同的碎片離子，如m/z316.2、158.1、116.1等。

此外，由于雜質KL和KO大環結構中肟基上的O是一個堿性位點，可以促進帶電質子在整個離子結構中的遷移，并引發相應的碎裂反應，所以會產生更多的碎片離子。比如，雜質KL質子化離子在丟失3號側鏈基團(KL3a-2P)后，還會繼續丟失5號側鏈基團產生碎片離子m/z448.3(12.5%)；雜質KO質子化離子會連續丟失3號和5號側鏈基團，產生碎片離子m/z462.3(1.4%)。

3 結論

本研究將串聯質譜技術和量化計算相結合，系統地研究了克拉霉素及其雜質KL和KO的質譜碎裂規律。量化計算結果表明，克拉霉素結構中的最優質子化位點為5號側鏈單元氨基N原子，其質子化離子經碰撞活化后發生一系列質子遷移和側鏈基團的碎裂反應：1) 帶電質子分別遷移到5號側鏈基團O5a和O5b上，引發丟失大環內酯單元或脫氧氨基糖苷開環反應，產生特征離子5a-P(m/z158.1)和5c-P(m/z116.1)；2) 帶電質子遷移到6號側鏈基團O6，并引發丟失甲醇，產生碎片離子6a-P；3) 帶電質子遷移到3號側鏈基團O3a，引發由5號側鏈單元O5d親核取代而導致吡喃糖單元遷移，并丟失大環內酯單元產生特征離子3a-1P(m/z316.2)，也可發生由對位羥基O3c親核取代引發的吡喃糖單元丟失碎裂，產生特征離子3a-2P，并繼續丟失甲醇分子產生特征離子3a-2P-P。本研究可為相關大環內酯類抗生素的雜質結構推導提供參考。