阿魏酸治療對去卵巢雌性大鼠骨量流失的保護作用機制研究

胡旭峰

皖南醫學院第一附屬醫院/弋磯山醫院，安徽 蕪湖 241000

骨質疏松癥是一種代謝性疾病，其特征是骨量減少和骨折風險增加，嚴重影響中老年人的健康[1]。骨吸收和骨形成動態失去平衡是骨質疏松癥的根本原因。骨重建是一個生理過程，其中成骨細胞形成新的骨骼，而破骨細胞重新吸收原始的骨基質，對維持成人骨骼健康起到關鍵作用，多種因素參與調節這一過程[2]。雙膦酸鹽、雌激素和雷洛昔芬通常用于治療絕經后骨質疏松癥，盡管這些藥物可顯著增加骨量，但它們具有一些局限性和副作用，包括血栓栓塞和胃腸道刺激[3]。阿魏酸(ferulic acid)是存在于多種水果中的天然多酚類藥物，對高血壓和胰島素抵抗有治療作用[4]。據報道[5-6]，阿魏酸不僅具有抗氧化劑活性，還能抑制成熟破骨細胞的融合和凋亡。有學者還報道[7]了補充阿魏酸可預防鏈脲佐菌素誘發的糖尿病大鼠脂質過氧化。這些結果顯示出阿魏酸可能對絕經后骨質疏松癥引起的骨丟失有保護作用。因此，本研究使用去卵巢模型初步探索阿魏酸治療骨質疏松癥的可行性，并研究其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

選取30只體重220～260 g、3月齡雌性SD大鼠 (購自上海實驗動物中心)作為實驗動物。每5只大鼠飼養在一個籠子里，光照時間為12 h/d，溫度為25 ℃，通風干燥；可以自由飲食，食物是標準大鼠飼料，含有2.5 %酪蛋白、0.8 %磷、1 %鈣、70 %～80 %碳水化合物和5 %脂肪。適應1周后，10只大鼠接受假手術(Sham)，其余大鼠行雙側卵巢切除術(OVX)。手術3 d后將大鼠分為3組(每組10只)：Sham組：假手術大鼠，給予生理鹽水[(50 mL/(kg·d)]灌胃；OVX組：去卵巢大鼠，給予生理鹽水[(50 mL/(kg·d)]灌胃；阿魏酸組：去卵巢大鼠,給予阿魏酸(20 mg/kg，Sigma-Aldrich)灌胃治療,1次/d，共12周；藥物劑量參考文獻[7]。治療結束時通過過量水合氯醛麻醉處死大鼠，獲取其雙側股骨行進一步檢測。并從大鼠左心室收集血液樣本(1 mL/只)，在4 ℃下以2 500 r/min 離心10 min來分離血清樣品，置于- 80 ℃下保存，備用。本研究得到皖南醫學院第一附屬醫院倫理委員會的批準(20191211)。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT檢測：應用Micro-CT CT50成像系統(Micro-CT CT50，Sanco Medical)評價大鼠左側股骨遠端的微觀結構。感興趣體積(VOI)包括從生長板最高點以下2.0 mm到遠端100層的骨小梁平掃圖片。對VOI區三維圖像進行定性和定量分析獲取骨體積百分比(BV/TV)、平均骨小梁厚度(Tb.Th)、平均骨小梁數目(Tb.N)、平均骨小梁間距(Tb.Sp)和骨密度(bone mineral density,BMD)。待Micro-CT掃描后，使用10 %乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，每周更換2次，連續4周，然后用分級乙醇系列(70 %～100 %)脫水。隨后進行石蠟包埋，長軸平行于基面。切取厚度為4 mm的縱向連續切片，固定在涂有聚賴氨酸的顯微鏡載玻片上，進行HE染色。染色方法按照制造商提供的方案進行，并在顯微鏡(奧林巴斯DP71顯微鏡，奧林巴斯公司)下檢查。

1.2.2血清生化檢測：根據制造商提供的方案，使用ELISA試劑盒(目錄號F8956和F18955；Westang Biological Technology Co.，Ltd.)檢測之前保存的血清樣品，檢測項目包括P1NP和TRACP-5b在內的骨代謝血清標志物。

1.2.3骨生物力學實驗：對大鼠股骨進行三點彎曲以確定股骨最大負荷和剛度。將左側股骨放在力學測試裝置上。將股骨放在支架的中間位置，以10 mm/min的持續測試速度加載直到股骨骨折。記錄數據，最后進行分析以獲得極限載荷(N)和彈性模量(mm2)。

1.2.4蛋白質印跡檢測：將股骨遠端在液氮中碎裂，并用放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液裂解。離心后，使用BCA蛋白質測定試劑盒測量上清液中的蛋白質水平。將每種蛋白質樣品(60 μg)裝入10 %(0.1 g /mL)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后，將膜用5 %(0.05 g/mL)牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉1 h，并與相對應的一抗(BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8、GAPDH)在4 ℃下過夜，然后在室溫下放置相應的二抗1 h，并用TBST(Tris-HCl 10 mmol/L，氯化鈉 150 mmol/L，Tween-20 0.05%(v/v);pH=7.5)洗滌3次。蛋白質表達信號通過增強的化學發光發光液可視化，并使用Tanon系統捕獲圖像。印跡的灰度值使用ImageJ軟件進行檢測。

1.3 統計學分析

實驗數據表示為均數±標準差。統計分析用SPSS 22.0軟件進行。基于方差結果的同質性檢驗，使用Student’st檢驗比較兩個不同組間差異。以P<0.05判斷差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 組織切片分析

股骨干骺端骨小梁的HE染色如圖1所示。Sham組顯示股骨干骺端骨小梁網狀結構正常；OVX組表現為疏松均勻的骨小梁變薄，導致骨小梁間隙變寬；阿魏酸組骨小梁數量和連接增加明顯，表現出明顯的結構恢復。

圖1 三組股骨的組織病理學注：A：Sham組；B：OVX組；C：阿魏酸組。HE染色(放大倍數，×40)。Fig.1 Histopathology of femurs in the three groups

2.2 阿魏酸治療對大鼠股骨骨小梁結構影響

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2 A所示。股骨干骺端的微觀參數如圖2B～圖2F所示。OVX組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)；阿魏酸組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖2 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果注：A：三組大鼠骨小梁三維重建；B：骨密度；C：Tb.Th；D：Tb.Sp；E：Tb.N;F：BV/TV;a:Sham組;b:OVX組;c:阿魏酸組。與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of the three groups of rats

2.3 阿魏酸治療對大鼠骨代謝指標的影響

阿魏酸治療對骨轉換標志物的影響見圖3。與Sham組相比，OVX組P1NP和TRACP-5b水平顯著升高(P<0.05)；與OVX組相比，阿魏酸組骨代謝指標P1NP和TRACP-5b水平顯著降低(P<0.05)。

圖3 阿魏酸治療對骨代謝指標的影響注：A：P1NP；B：TRACP-5b。與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.3 Effect of Ferulic acid treatment on the bone metabolism indexes

2.4 阿魏酸治療對大鼠股骨生物力學的影響

股骨三點彎曲試驗如圖 4所示，OVX組的極限載荷和彈性模量均顯著低于Sham組，兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，阿魏酸組的極限載荷和彈性模量較OVX組明顯升高(P<0.05)。

圖4 右股骨的三點彎曲試驗結果注：A:極限載荷；B:彈性模量。與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.4 Three-point bending test results of the right femur of rats

2.5 阿魏酸治療對BMP2/Smads信號通路的影響

與Sham組比較，OVX組BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表達水平明顯下調，比較差異有統計學意義(P<0.05)；與OVX組比較，阿魏酸組BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表達水平上調，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖5 使用WB檢測BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8和GAPDH的相對表達注：A：各組目標蛋白的表達：B：BMP-2、Smad1、Smad4、p-Smad1/5/8表達；與Sham組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05。Fig.5 Relative expression of BMP-2,Smad1,Smad4,p-Smad1/5/8 to GAPDH using Western blotting

3 討論

目前臨床上用于治療絕經后骨質疏松癥的藥物以雙膦酸鹽、雌激素受體調節劑或者甲狀旁腺素(1-34)為主[8]。盡管這些藥物都有一定的療效，但它們也存在不同程度的局限性。骨質疏松癥治療的目的是恢復骨骼的正常代謝，即增強成骨功能并減少由于骨質疏松癥的病理性骨吸收而導致的骨強度降低。OVX大鼠和絕經后女性的雌激素缺乏相似，均出現BMD降低[9-10]。在本研究中，阿魏酸治療可顯著改善BMD，并有效防止OVX誘導的雌激素缺乏引起的骨量流失。

本研究中的生物力學測試表明，與Sham組相比，OVX組大鼠股骨骨折所需的力量較小。阿魏酸治療顯著改善了去卵巢大鼠股骨生物力學性能。骨強度與骨密度、結構、連通性和礦化有關[11]。本研究的結果與以前研究的結果一致，卵巢切除術導致BMD降低以及生物力學強度顯著降低[12]。

骨質疏松癥的主要原因是骨吸收與骨形成之間的不平衡。健康的骨骼需要保持成骨細胞和破骨細胞之間的動態平衡，以進行適當的骨骼重塑[13]。血清骨代謝指標的變化反映了骨骼代謝的平衡。這些變化可用于評估骨轉化，并客觀地反映骨吸收和骨形成。TRACP-5b是破骨細胞分泌的細胞因子，在骨重塑中起重要作用。P1NP被認為是骨轉換的標志，由成骨細胞分泌，在成骨細胞分化和骨形成活性中起著重要的作用。本研究結果表明，與Sham組大鼠相比，OVX組大鼠的P1NP和TRAP-5b水平顯著升高。使用阿魏酸治療12周后能顯著降低P1NP和TRACP-5b水平，表明阿魏酸具有糾正骨吸收與骨形成之間不平衡的能力。

BMPs是轉化生長因子β超家族的成員。幾項研究[14-15]表明，BMPs可以激活Smad蛋白家族的下游信號分子，刺激間充質細胞分化，并不可逆地誘導骨骼和軟骨的形成。BMP-2可通過經典的BMP/Smad途徑調節成骨細胞分化。該信號傳導途徑由II型BMP受體啟動，激活后通過磷酸化BMP特異性Smad1、Smad5和Smad8傳播BMP信號。然后，p-Smad1/5/8與Smad4結合形成復合物，該復合物易位至細胞核并激活或抑制成骨基因的轉錄。BMP/Smads信號通路的激活是調控骨髓間充質干細胞成骨分化和抑制破骨細胞介導的骨吸收在骨重塑中的重要調控機制[16]。本研究發現OVX組的BMP-2、Smad1、Smad4和p-Smad1/5/8表達水平較Sham組顯著降低，表明OVX組大鼠BMP/Smads信號通路的被抑制，而在經過阿魏酸治療后，BMP-2、Smad1、Smad4和p-Smad1/5/8較OVX組顯著上調，這表明BMP/Smads信號通路已經被激活，最終出現一系列信號傳導導致骨代謝失衡糾正，骨量和骨強度增加。

綜上所述，本研究表明阿魏酸能夠改善去卵巢大鼠的骨量丟失，而這種結果可能是由BMP/Smads信號通路激活而介導的。由于骨質疏松癥機制復雜，本研究只是初步證實了阿魏酸具有抗骨質疏松癥的潛力，需要進一步擴大樣本量和研究時間來證實藥物的有效性與安全性。