R-spondins調控WNT/β-catenin信號通路的機制及其對骨骼系統的影響

陳明洲 李朝旭 貴鵬 劉繼鴻 王龍 徐渠

1.桂林醫學院研究生學院，廣西 桂林 541004 2.廣西壯族自治區南溪山醫院創傷手外科，廣西 桂林 541002

R-spondins由2002年發現于10～12 d小鼠胚胎頂板和神經上皮表達的R-spondin 1及之后發現R-spondin 2、R-spondin 3、R-spondin 4組成，對R-spondin家族的作用一直存在著爭議。隨著R-spondin家族受體LGR 4/5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs和IQGAP1的發現，R-spondins增強WNT/β-catenin信號通路在胚胎發育、器官穩定、干細胞自我更新中的作用被予以證實。近來研究發現R-spondins通過WNT/β-catenin信號通路調控骨髓間充質干細胞、成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞參與胚胎骨發育、成體骨形成和骨關節疾病的發生發展，對R-spondins的研究可能成為骨代謝疾病新的治療方向。本文將對R-spondins增強WNT/β-catenin信號通路的相關機制及其對胚胎骨發育、成體骨形成、骨質疏松和骨關節炎的影響做一綜述。

1 WNT/β-catenin信號通路

WNT信號通路是指富含半胱氨酸的分泌糖蛋白WNTs家族與受體結合進而激活一系列細胞內級聯反應的重要細胞通路[1]。WNT信號通路能協調多細胞生物胚胎發育、維持成體組織器官穩定，而異常的WNT信號通路與多種遺傳性疾病、代謝性疾病、腫瘤等疾病密切相關[2-3]。WNT信號通路分為依賴β-catenin的WNT/β-catenin信號通路(又稱經典WNT 通路)和不依賴β-catenin的非經典 WNT通路。相比于WNT/β-catenin信號通路，非經典通路更加復雜。主要包括WNT/PCP(planner cell polarity)通路、WNT/Ca2+通路和其他非β-catenin/TCF依賴的通路[4-5]。

在WNT/β-catenin信號通路中，對β-catenin的調控處于中心地位。腺瘤樣結腸息肉蛋白(adenomatosis polyposis coli，APC)、骨架蛋白(axin)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶GSK3(glycogen synzhase kinase 3)和CK1(casein kinase 1)、低密度脂蛋白5/6(low density lipoprotein receptor-related proteins 5/6，LGP5/6)、T細胞因子(T-cell factor，TCF)轉錄因子均是WNT/β-catenin信號通路的重要成員。

當無WNTs刺激時，胞質內的“破壞復合物”(由APC/axin/GSK3和CK1組成)中的GSK3和CK1會磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin會被蛋白酶體降解，WNT/β-catenin信號通路隨之關閉。當存在WNTs刺激時，WNTs與細胞膜上七次跨膜Frizzld受體和LRP5/6共受體同時結合，導致了“破壞復合物”解體，從而抑制β-catenin的降解，胞質內β-catenin增加，進而轉移進入細胞核內與TCF轉錄因子結合，激活WNT/β-catenin信號通路[1-2]。

2 WNT/β-catenin信號通路調控蛋白R-spondins

2.1 R-spondins組成及結構特點

R- spondins是包含TSR-1結構域的超家族成員，包括R-spondin1、R-spondin 2、R-spondin 3和R-spondin 4四種分泌糖蛋白成員。這些蛋白的分子量大約為35 kDa，它們60 %的氨基酸序列和保守結構區域是相同的，四種R-spondin都含有三個相似的特殊保守結構域：氨基末端的兩個富含半胱氨酸的Furin結構域、TSR-1結構域、羧基末端富含堿性氨基酸的結構域[6]。TSR-1結構域可能與蛋白多糖結合有關，兩個Furin結構域則可分別與ZNRF3/RNF43、LGR4/5/6結合從而介導調控WNT/β-catenin信號通路[7]。

2.2 R-spondins增強WNT/β-catenin信號通路的相關機制

研究[8]發現LGR4/5/6是R-spondins的高親和受體。ZNRF3/RNF43通過泛素化和后續的串聯反應可降解WNT信號通路細胞表面Frizzld受體，發揮WNT信號通路的負反饋調節作用[9-10]。

Hao等[11]提出了R-spondins-LGR4/5-ZNRF3/RNF43信號傳導單元調控WNT/β-catenin信號通路的機制。WNTs與LRP4/5/受體和Frizzld共受體同時結合通過WNT/β-catenin信號通路，使胞質內β-catenin增加，進而轉移進入細胞核內與TCF轉錄因子作用，激活ZNRF3/RNF43基因表達ZNRF3/RNF43并轉運至細胞膜上。當沒有R-spondins存在時，細胞膜上的ZNRF3/RNF43通過胞質內的接頭蛋白(dishevelled，DVL)識別Frizzld受體，誘導Frizzld受體泛素化和降解，從而抑制WNT/β-catenin信號通路。當R-spondins存在時，R-spondins與其受體LGR4/5和細胞膜ZNRF3/RNF43同時結合，誘導ZNRF3/RNF43泛素化和降解，進而阻斷Frizzld受體泛素化和降解，增強WNT/β-catenin信號通路[8-11]。R-spondins-LGR4/5-ZNRF3/RNF43信號傳導單元保證了WNT/β-catenin信號通路穩定，參與維持消化道干細胞的自我更新和分化，促進消化上皮損傷修復和腺體再生[12-14]。此外，在ZNRF3/RNF43降解的基礎上，R-spondins-LGR4還可以通過招募IQGAP1來誘導LRP5/6磷酸化增強β-catenin活性，提高WNT/β-catenin信號通路調節細胞的黏附和遷移能力[15]。

目前已經有相關報道[16]發現R-spondin1-4在增強WNT/β-catenin信號中對LGRs有不同的需求，特別是R-spondin 2和R-spondin 3在沒有LGRs的情況下也能夠增強WNT/β-catenin信號通路。R-spondin 2/3可通過與HSPGs和ZNRF3/RNF43相互作用，誘導細胞膜表面ZNRF3/RNF43降解來增加Frizzld受體積累，增強WNT信號通路[17]。在敲除LGRs的體細胞中R-spondin 2和R-spondin 3仍可以增強WNT信號通路。在小鼠和爪蟾胚胎發生過程中，伴隨著LGR4、LGR5和LGR6受體的丟失并不表現為R-spondin 2或R-spondin 3相關表型的丟失[18]。以上報道各自獨立而又相互證明了R-spondin 2和R-spondin 3或許不需要LGR4/5/6參與，發揮抑制RNF43/ZNRF3增強WNT信號通路的分子機制。在病理情況下，由于R-spondins基因融合突變、轉錄因子異常激活，R-spondins通過上述機制中LGR 4/ 5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs、IQGAP1相關因子參與乳腺癌、結直腸癌、胃癌、肺癌、骨髓瘤等多種腫瘤的進程[19-23]。

3 R-spondins在骨骼發育和骨相關疾病中的作用

3.1 R-spondins對胚胎骨發育的影響

R-spondins廣泛表達于小鼠顱面骨、四肢骨和軀干骨胚胎發育的各個時期[7]，R-spondin 2基因敲除小鼠觀察到其下肢遠端趾骨和腓骨、上肢遠節指骨和橈骨丟失同時伴有腭裂和顱面畸形，有趣的是相似的骨骼發育缺陷也出現在干擾WNT/β-catenin信號通路的小鼠模型中，盡管R-spondin 3基因敲除小鼠無明顯的骨骼異常，但在R-spondin 2和R-spondin 3雙基因敲除的小鼠中檢測到更嚴重的骨骼畸形，表明R-spondin 2和R-spondin 3在功能上有一定程度的重疊[24]。Szenker-Ravi等[18]通過對5組人類家庭的11個肢體畸形胎兒的研究發現，R-spondin 2基因突變的4個胎兒表現為橈骨、脛骨缺失伴或不伴肱骨、股骨發育不良，以及胚胎前軸側手指缺失，其他7個胎兒表現為部分Tetra-amelia綜合征(四肢完全缺失、肺發育不全、唇腭裂和唇腭溝發育不全)，這與敲除小鼠R-spondin 2基因畸形相似。另外人類手掌、足跖部分區域皮膚角化過度異常增厚與R-spondin1基因的突變相關，R-spondin 4基因錯位與人類常染色體隱型疾病四肢指甲缺失高度相關[6]，這些過程最有可能通過激活WNT/β-catenin信號通路實現。

3.2 R-spondins對成體骨發育的影響

成骨細胞的成骨同破骨細胞的骨吸收之間保持平衡對成體骨的維持和重建至關重要，研究證實WNT/β-catenin信號通路影響成骨細胞和破骨細胞的生物學行為，在骨合成代謝方面具有重要作用[25]。Sharma等[26]發現在人類原代成骨細胞和人類成骨祖細胞系FOB 1.19細胞的分化過程中，R-spondin1表達增加。在FOB 1.19細胞中，敲除R-spondin 1導致堿性磷酸酶活性降低而轉染R-spondin1，通過激活WNT/β-catenin信號通路促進成骨細胞分化，提高堿性磷酸酶活性。相似的結果在小鼠成骨細胞模型MC3T3-E1細胞(成骨前細胞系)中也得到證實。這些結果證明R-spondin1可能通過自分泌的形式促進體外成骨細胞的成骨活性。

Zhu等[27]發現R-spondin 2-LGR4通過激活WNT/β-catenin信號通路，促進MC3T3-E1細胞(成骨前細胞系)的分化、成骨并能抑制破骨細胞的生成，而在小鼠OVX模型(雌激素缺乏導致進行性骨質疏松小鼠模型)體內試驗中，外源性R-spondin 2改善了OVX小鼠脛骨近端的骨丟失和骨小梁結構，同時促進小鼠骨形成，增加骨質量。Knight等[28]則通過對R-spondin 2基因敲除導致肢體發育缺陷的小鼠模型以及構建完全敲除R-spondin 2基因的小鼠模型研究，發現R-spondin 2調節成骨細胞的生成和礦化，破壞R-spondin 2表達干擾骨骼礦物質沉積、骨骼形成，導致骨量減少和骨強度下降。另外破壞R-spondin 2小鼠特殊骨骼表型與干擾LGR5/6的WNT/β-catenin信號通路表型相似，對敲除R-spondin 2小鼠的分析也發現了WNT/β-catenin信號通路的抑制。

軟骨細胞在軟骨骨化過程中按靜止軟骨區域、增殖軟骨細胞區域、軟骨細胞成熟/肥大區域順序分化，然后被成骨細胞取代。在增殖軟骨區域的軟骨細胞表達轉錄因子Sox 9，分泌II型膠原(collagen type II，CII)和蛋白聚糖(aggrecan，Acan)等基質蛋白[29]，成熟/肥大區域的軟骨細胞則表達另一個轉錄因子Runx 2[30]。Takegami等[31]發現R-spondin 2基因敲除的小鼠模型中軟骨細胞的β-catenin的含量減少，而Sox 9和CII的含量增加。通過對ATDC 5軟骨細胞系R-spondin 2的過表達和敲除對比研究，發現R-spondin 2激活WNT/β-catenin信號通路抑制增殖軟骨細胞Col2a1、Sox 9、Acan表達但不抑制成熟/肥大軟骨細胞Runx 2表達。支持R-spondin 2激活軟骨細胞WNT/β-catenin信號通路促進軟骨內成骨過程中增殖軟骨細胞向肥大軟骨細胞分化。體內外試驗均表明R-spondin 2是一種有效的骨代謝正向調控因子。

Moayyeri等[32]通過對人類足跟骨定量超聲和足跟骨平片全基因組相關研究的薈萃分析發現，R-spondin 3基因與人類骨密度和骨折風險存在顯著關聯性，暗示R-spondin 3可能參與骨代謝。

3.3 R-spondins對骨代謝疾病的影響

廢用性骨質疏松癥是由于骨骼缺少機械刺激而導致骨量減少，普遍存在于骨折固定、神經肌肉疾病或脊髓損傷等長期患肢制動的患者中[33]。Shi等[34]發現R-spondin 1在骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的過程中動態表達，R-spondin1-LGR4通過激活WNT/β-catenin信號通路增強骨髓間充質干細胞成骨分化和骨形成。在體外連續循環機械拉伸(continuous cyclic mechanical stretch，CMS)機械刺激下，R-spondin 1在小鼠骨髓間充質干細胞中表達增加，而在后肢懸吊(tail suspension，TS)機械刺激去除小鼠模型中R-spondin 1的表達下降。過表達R-spondin 1可顯著改善TS小鼠的骨量丟失。R-spondin 1是一種機械刺激敏感蛋白，R-spondin 1-LGR4是潛在的防治廢用性骨質疏松癥的靶點。

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是以關節軟骨的退行性變和關節周圍繼發性骨質增生為特征的慢性關節疾病，疼痛、功能障礙和畸形是其主要的臨床表現[35]。Okura等[36]發現OA患者關節滑膜液中R-spondin 2含量隨著OA的嚴重程度逐漸增加，米安色林可以通過抑制軟骨細胞中R-spondin 2誘導的WNT/β-catenin信號通路，改善和預防內側半月板失穩膝關節OA小鼠模型關節軟骨的降解。巨噬細胞是單核細胞進入外周組織后分化而來重要免疫細胞，不同局部微環境刺激巨噬細胞可分化成為具有不同功能的表型(即極化)，包括M1 型巨噬細胞和M2 型巨噬細胞，它們在機體病原微生物與衰老細胞的清除、促進和抑制炎癥反應、誘發適應性免疫反應及損傷組織的修復與重構都發揮重要作用[37]。Zhang等[38]發現在OA患者和膠原酶誘導的骨關節炎(collagenaseinduced osteoarthritis，CIOA)小鼠模型關節滑膜組織中，mTORC1信號的激活增強了M1型巨噬細胞極化同時減弱M2型巨噬細胞極化，進一步研究發現M1巨噬細胞通過分泌R-spondin 2，促進了關節軟骨的退化、降解和骨贅生物的形成。誘導的OA在小鼠中的發展，證實M1巨噬細胞和R-spondin 2是OA治療的潛在靶點。

4 結論與展望

隨著LGR4/5/6、ZNRF3/RNF43、HSPGs、IQGAP1的發現，R-spondins增強WNT/β-catenin信號通路的機制逐漸清晰。在骨骼系統中R-spondins在胚胎骨骼發育的各個階段廣泛表達，R-spondins不但與人類四肢骨骼發育畸形和缺失密切相關，而且能夠通過增強WNT/β-catenin信號通路，促進增殖軟骨細胞和成骨細胞分化、抑制破骨細胞的生成，有助于成體骨形成和維持骨密度，有力的證明了R-spondin家族是一種骨代謝正向調控因子。另外R-spondin 1、R-spondin 2參與廢用性骨質疏松癥、骨關節炎骨代謝疾病的發展，同時米安色林通過抑制R-spondin 2改善骨關節炎的進展，也顯示出靶向R-spondins治療骨丟失和骨關節炎等相關骨代謝疾病的潛力。

雖然R-spondins在骨組織中仍然有許多問題等待解決，包括R-spondin家族成員種類多樣、功能影響復雜，對R-spondins調控WNT/β-catenin信號通路的機制和相關因子仍需做進一步研究。但是對于R-spondins應用于骨合成代謝相關疾病治療的前景依然值得期待。