MC3T3-E1細(xì)胞在不同機(jī)械應(yīng)力刺激下成骨表達(dá)機(jī)制的研究進(jìn)展

宋志靖 王薇* 宋敏* 董萬濤 鞏彥龍 王凱 范凱 張亞彬

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州730000

機(jī)械應(yīng)力是刺激骨組織生長的有效條件，就如Wolff 定律指出的一樣，是生物體內(nèi)的一種生理刺激的需要。缺乏機(jī)械應(yīng)力刺激的生物體，其維持骨重建與動態(tài)平衡機(jī)制將出現(xiàn)偏離，最終形成骨質(zhì)疏松。骨細(xì)胞存在于骨基質(zhì)中，感知機(jī)械載荷的變化，并通過成骨細(xì)胞產(chǎn)生改變骨形成的信號。成骨樣細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞作為力學(xué)刺激敏感細(xì)胞，是研究骨生長、發(fā)育、成形機(jī)制的基本單位，也是研究應(yīng)力學(xué)環(huán)境下成骨機(jī)制的經(jīng)典細(xì)胞。目前，對離體MC3T3-E1細(xì)胞有多種機(jī)械應(yīng)力刺激方式:持續(xù)靜壓力、流體剪切力、震蕩流體剪力、張應(yīng)變(單/雙向拉伸牽拉應(yīng)力)、機(jī)械離心力、高重力(超重)、微重力(失重)、強(qiáng)磁重力環(huán)境等，這些不同方式的機(jī)械應(yīng)力刺激影響著MC3T3-E1細(xì)胞的成骨表達(dá)過程。

1 持續(xù)靜壓力

流體單位面積所受到的垂直于該表面上的力稱為流體的靜壓強(qiáng)，也稱靜壓力，持續(xù)作用一定時長稱為持續(xù)靜壓力(continuously compressive pressure,CCP)。研究顯示，給MC3T3-E1細(xì)胞加1 atm持續(xù)靜壓力，細(xì)胞Clcn3mRNA表達(dá)顯著上升，表明成骨細(xì)胞CLC-3氯通道對壓力刺激敏感[1]，周期性動態(tài)壓力可促進(jìn)CLC-3表達(dá),增加細(xì)胞膜表面CLC-3離子通道的數(shù)量[2]。將MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞分別施加50、100、150 kPa的持續(xù)靜壓力1 h，再分別培養(yǎng)24、48 h后，細(xì)胞表面ADAM家族中金屬蛋白酶解離素28(ADAM28)的表達(dá)明顯減弱，表明在骨改建過程中，ADAM28與成骨細(xì)胞活性、增殖關(guān)系密切[3]。給MC3T3-E1細(xì)胞施加2 atm的CCP，觀察不同時間細(xì)胞TD、ALP、OCN的變化，說明持續(xù)性靜壓力可能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，加速骨基質(zhì)的鈣化[4]。研究[5]顯示，在CCP刺激下，MC3T3-E1細(xì)胞的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)信號通路與多種骨代謝過程有關(guān)，主要通過典型的Smad蛋白依賴性途徑(TGF-β/BMP配體、受體和Smad蛋白)和非典型Smad獨(dú)立信號通路(MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β/BMPs的p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路)發(fā)揮作用。前者在成骨作用方面不可或缺，后者直接影響細(xì)胞骨架的力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞骨架重構(gòu)和聚合。

2 流體剪切力

壓縮、拉伸、剪切力導(dǎo)致的組織變形使組織液在細(xì)胞周圍運(yùn)動，這種組織液的移動誘導(dǎo)出流體切應(yīng)力,又叫流體剪切力(fluid shear stress，F(xiàn)SS)。它廣泛存在于骨骼微循環(huán)中，促進(jìn)成骨機(jī)制[6]。研究[7]顯示，ERK5信號通路調(diào)控FSS對MC3T3-E1細(xì)胞 MMPs、TIMPs蛋白的表達(dá)，能夠顯著地促進(jìn)OPGmRNA表達(dá),降低RANKLmRNA表達(dá)[8]，也可增強(qiáng)BMP2、BMP7mRNA的表達(dá)，并通過ER-α-ERK5信號通路上調(diào)CDK4和Cyclin D1，從而使MC3T3-E1細(xì)胞增殖[9]。同時，F(xiàn)SS激活ERK5-AKT-FoxO3a信號通路，抑制caspase-3的激活，起到保護(hù)成骨細(xì)胞凋亡的作用[10]。除ERK5信號通路外，通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)[11]，F(xiàn)SS涉及的信號通路還主要包括Notch信號通路、RIG-Ⅰ樣受體信號通路等。還涉及前列腺素的生物合成、NO的信號傳導(dǎo)、鈣介導(dǎo)的信號及細(xì)胞免疫反應(yīng)等不同的功能分類。在流體剪切力的作用下，MC3T3-E1細(xì)胞骨架進(jìn)行重構(gòu)，F(xiàn)-actin蛋白向一個方向排列，并且更加緊密。同持續(xù)性流體剪切相比，間歇(周期)性流體剪切力(cyclic fluid shear stress，cFSS)和震蕩流體剪切力(oscillatory shear stress，OSS)能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，二者通過ERK5信號通路在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖中發(fā)揮的作用，CyclinD1是ERK5信號通路下游的重要靶點(diǎn)基因[12]。此外，雌激素(比如17β-雌二醇)、BMP2和整合素β1通路交互調(diào)控與FSS對成骨細(xì)胞的分化和增殖具有協(xié)同作用[13-15]。而且，Piezo1離子通道是一個機(jī)械敏感的離子通道，成骨細(xì)胞通過它感知和響應(yīng)機(jī)械載荷的變化，是液體剪切應(yīng)力引起的基因表達(dá)變化所必需的[16-17]。但也有研究[18]顯示，超過1 h的FSS刺激會對MC3T3-E1細(xì)胞造成損傷。所以，F(xiàn)SS刺激量和作用時間對細(xì)胞造成的損傷機(jī)制有待進(jìn)一步揭示。

3 張應(yīng)變

每一種應(yīng)力作用在物體都可產(chǎn)生相對應(yīng)的應(yīng)變，張應(yīng)力(單/雙向拉伸牽拉應(yīng)力)作用前后物體長度、形狀及體積變化之比稱為張應(yīng)變(tensile strain)。被稱為矯形外科米開朗基羅的Ilizarov教授[19]在上世紀(jì)五六十年代成功地應(yīng)用牽拉應(yīng)力刺激骨形成，奠定了牽張應(yīng)力下骨形成的理論，即“牽張成骨”理論。此后，該理論廣泛應(yīng)用在骨科臨床中，臨床療效確切。但其成骨機(jī)制在微觀領(lǐng)域的研究還需深入。有研究者[20]作了初步探索，在特定周期性牽拉應(yīng)力作用下，促進(jìn)三維培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞增殖和OPN mRNA的合成，抑制ALP活性，機(jī)械張應(yīng)變增加了IGF-1和PGE2的分泌，提高了OPG、(IL)-6表達(dá)和NOS活性，從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化能力,周期性循環(huán)拉伸可顯著提高成骨膠原合成。但是，細(xì)菌炎癥可抑制拉伸應(yīng)變誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中Runx2/Cbfalpha1的表達(dá)，上調(diào)c-fos的表達(dá),降低成骨細(xì)胞在持續(xù)的拉伸應(yīng)力下恢復(fù)成骨的能力[21-22]。在信號通路中，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控成骨細(xì)胞成骨作用中發(fā)揮著重要作用[23]，分別采用3 %、6 %、12 %形變幅度的正弦波對MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行牽張應(yīng)力干預(yù)，不同時間節(jié)點(diǎn)干預(yù)后，可上調(diào)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。亦可增強(qiáng)ALP 活性，影響Wnt1、Runx2、OC、Osterix、β-catenin mRNA 表達(dá)升高，而 DKK-1 mRNA 表達(dá)下降[24]。

4 機(jī)械離心力

機(jī)械離心力(centrifugation)是一種虛擬力，是一種慣性的體現(xiàn)，是物體在做圓周運(yùn)動時所產(chǎn)生的一種離心運(yùn)動現(xiàn)象。在機(jī)械加載作用下，它使旋轉(zhuǎn)的物體遠(yuǎn)離它的旋轉(zhuǎn)中心。研究顯示[25-27]，機(jī)械離心力刺激顯著增加了MC3T3-E1細(xì)胞中Peiostin (OSF-2) semaphorin-3AmRNA的表達(dá)。同時，對力學(xué)靶點(diǎn)Runx2響應(yīng)顯著，Runx2/Cbfa1蛋白及基因都是力學(xué)刺激的關(guān)鍵目標(biāo)，是BMP信號成骨特異性基因表達(dá)，是力學(xué)刺激在成骨細(xì)胞內(nèi)作用的終極靶點(diǎn)，在機(jī)械離心力刺激的過程中BMP的全程參與，在力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞級聯(lián)反應(yīng)這一過程中的作用不可或缺。同時，機(jī)械離心力載荷誘導(dǎo)的c-fos表達(dá)主要依賴于cAMP，而非PKC[28]。有研究者[29]應(yīng)用離心結(jié)合熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)，制備了MC3T3-E1細(xì)胞附著的納米纖維管狀聚(l -乳酸)(PLLA)支架，具有顯著的骨組織再生潛力，在材料科學(xué)和組織工程方面進(jìn)行新的探索。

5 重力

物體由于地球的吸引而受到的力稱為重力(gravity)。對成骨細(xì)胞 MC3T3-E1的影響包括高重力(超重)、微重力(失重)、強(qiáng)磁重力。

高重力(hypergravity)也稱超重，是指物體對支持物的壓力大于物體所受重力的現(xiàn)象。它可引起成骨細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排和細(xì)胞形態(tài)改變。成骨細(xì)胞 MC3T3-E1可響應(yīng)高重力，細(xì)胞骨架高度與有序性降低，排列松散，微絲肌動蛋白束狀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)彌散狀，細(xì)胞變扁，細(xì)胞表面積明顯增大。高重力可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟分化，且較高水平(10、15、20 g) 高重力的促進(jìn)作用更顯著[30-31]。

微重力(microgravity)也稱失重，是指物體對支持物的壓力小于物體所受重力的現(xiàn)象。在微重力環(huán)境下機(jī)體能感受到的表觀重量遠(yuǎn)小于實(shí)際重量。該環(huán)境下可導(dǎo)致骨量丟失，肌肉松弛，形成骨質(zhì)疏松。研究[32]顯示，微重力影響細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子及其受體和絲裂原活化蛋白激酶，并誘導(dǎo)細(xì)胞骨架微絲解聚，可以調(diào)控 NO/NOS 系統(tǒng)而影響信號傳導(dǎo)。通過抑制 AK的磷酸化形式抑制前成骨細(xì)胞的增殖[33]。但在微重力環(huán)境下，亦可激活相關(guān)成骨機(jī)制，又促進(jìn)成骨。在微重力環(huán)境中，MC3T3-E1細(xì)胞的ALP、OCN、CoL-Ⅰ的基因和蛋白水平表達(dá)下調(diào)，同時激活NF-κB信號通路促進(jìn)成骨表達(dá)[34]。也有研究[35-36]從藥物防護(hù)角度進(jìn)行了干預(yù)，在SMG條件下，奧金肽(osgentide，OST)、成骨生長肽(OGP10-14)能夠促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖并保護(hù)其成骨機(jī)制，為研究微重力下防治骨丟失提供了理論依據(jù)。

強(qiáng)磁重力環(huán)境(high magneto-gravitational environment,HMGE)是大梯度強(qiáng)磁場與重力產(chǎn)生的復(fù)合人工物理環(huán)境，該環(huán)境下對細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生系統(tǒng)性影響。研究[37]顯示,7 d礦化階段的MC3T3-E1細(xì)胞對HMGE更敏感,磁場促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，還增加胞內(nèi)游離鈣離子濃度。然而，HMGE對MC3T3-E1細(xì)胞的形態(tài)及增殖影響不明顯，但在強(qiáng)磁失重環(huán)境中抑制MG63細(xì)胞CaM/CaMKⅡ信號[38]和鈉、鎂、鈣等元素的相對百分含量[39]。說明同為成骨細(xì)胞的不同細(xì)胞株對該環(huán)境反應(yīng)不同，揭示成骨細(xì)胞功能的多樣性，及對外界應(yīng)力應(yīng)變的差異性。

6 小結(jié)與展望

機(jī)械應(yīng)力的加載和卸載可以影響成骨細(xì)胞的成骨機(jī)制進(jìn)程和功能。研究顯示，MC3T3-E1細(xì)胞對機(jī)械應(yīng)力信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)通過Piezo1和Trpv4、Ca2+通道、ClC-3氯通道、胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)系統(tǒng)、細(xì)胞調(diào)控因子等多種途徑入核作用于靶基因，并調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控相應(yīng)力學(xué)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為化學(xué)信號，通過化學(xué)感受器調(diào)控細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核的各類感受器進(jìn)行成骨，這種細(xì)胞對力學(xué)刺激的接收、傳導(dǎo)構(gòu)成了一個復(fù)雜的力學(xué)信息響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。同時，成骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架在不同應(yīng)力信息網(wǎng)絡(luò)傳輸過程中起到了重要而顯著的作用[40]，MC3T3-E1細(xì)胞的肌動蛋白骨架具有識別細(xì)胞狀態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)礦化、骨形成的功能，是成骨細(xì)胞的機(jī)械傳感器[41]。MC3T3-E1細(xì)胞由外及內(nèi)的力學(xué)刺激與轉(zhuǎn)導(dǎo)是其內(nèi)在微環(huán)境中一個不可或缺的重要生理因素，細(xì)胞骨架作為機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)化為化學(xué)刺激信號的前哨，是感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)力學(xué)信號的重要環(huán)節(jié)。

不同力學(xué)刺激機(jī)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)有不同的調(diào)控方式，尋找機(jī)械應(yīng)力刺激對骨骼重建與保持其穩(wěn)定活力的機(jī)制和契合點(diǎn)、準(zhǔn)確把握機(jī)體對機(jī)械應(yīng)力刺激的強(qiáng)度、持續(xù)時間、循環(huán)周期等生理需求，改善骨骼微環(huán)境、促進(jìn)骨骼代謝意義重大。研究成骨細(xì)胞株MC3T3-E1細(xì)胞不同形式力學(xué)刺激對細(xì)胞的影響機(jī)制以及應(yīng)力刺激下的藥物干預(yù)機(jī)制，有助于闡釋臨床骨折愈合、骨骼功能健康、骨病發(fā)生等方面機(jī)制，通過細(xì)胞微觀研究為臨床宏觀應(yīng)用藥物防治骨科疾病提供理論基礎(chǔ)和物質(zhì)基礎(chǔ)。未來，不同力學(xué)刺激下MC3T3-E1細(xì)胞成骨機(jī)制的研究將進(jìn)一步深入，同時，也為藥物干預(yù)不同應(yīng)力環(huán)境中成骨細(xì)胞成骨機(jī)制和細(xì)胞修復(fù)研究打開了空間。