維生素E治療對老年雌性大鼠骨量、骨代謝以及自噬水平影響

楊海超 黃煒 韓曉東

唐山市工人醫院，河北 唐山 063000

老年骨質疏松癥的發病率隨著世界人口的老齡化而逐漸增加。由于高昂的醫療費用、高風險殘疾率、與死亡風險增加密切相關[1]，老年骨質疏松性骨折已成為一個重要的公共衛生問題。然而，有關老年性骨量流失的病理生理分子機制尚不完全清楚。隨著年齡的增長，骨細胞數量明顯減少，骨細胞自噬和凋亡增加[2]。自噬是一種進化保守的生理過程，是生存、分化、發育和細胞內穩態所必需的[3]。自噬的基礎水平作為一種重要的細胞垃圾處理機制，通過去除功能異常的細胞器和錯誤折疊的蛋白質來維持細胞內環境的穩態[4]。此外，隨著年齡的增長，骨細胞的自噬功能減弱可能與老年骨質疏松的發生發展有關[4]。最近有研究[5]表明，自噬是骨細胞抵抗糖皮質激素有害影響的主要保護機制。近年來的研究[6]表明抗氧化劑可以通過改變體內的自噬水平減少骨質疏松大鼠骨量的流失。隨著年齡的增長，骨細胞自噬的失敗可能是老年性骨質疏松發生的原因之一，因此改變自噬水平可能成為治療老年性骨質疏松的治療靶點。本研究的目的是探討抗氧化劑維生素E對老年雌性大鼠骨密度、骨代謝和自噬水平影響。

1 材料和方法

1.1 材料

選取3月齡雌性Sprague-Dawley大鼠10只、體重230～250 g作為對照組；另選取24月齡雌性Sprague-Dawley大鼠20只，體重487～532 g，均購于上海實驗動物中心。大鼠飼養在室溫(23±2)℃環境下，12/12 h光暗循環，喂食標準大鼠飼料和水。將老年大鼠隨機分為模型組(n=10)和治療組(n=10)。所有大鼠適應性飼養1周。

1.2 方法

1.2.1維生素E治療：將3 g維生素E (Sigma，USA) 溶解在50 mL橄欖油(Bertolli，Lucca，意大利)中，以獲得60 mg/kg劑量的溶液[7]，治療組給予大鼠每天60 mg/kg維生素E灌胃治療。本研究中使用的維生素E含有162.2 mg/g α-生育酚，167.1 mg/g α-生育三烯醇，35.4 mg/g β-生育三烯醇，266.2 mg/g γ-生育三烯醇和90.7 mg/g δ-生育三烯醇，劑量表現出對骨量保護作用[7]；大鼠每天60 mg/kg的劑量相當于體重60 kg的人每天攝入583 mg維生素E。其它組的大鼠給予同樣劑量的橄欖油治療。治療12周后，在禁食12 h后對大鼠實施安樂死，獲取血液和雙側股骨標本。本研究得到醫院倫理委員會批準(201922344)。

1.2.2Micro-CT和HE染色評估:通過Micro-CT(SkyScan 1176，Bruker-microCT，Kontich，Belgium)檢測大鼠股骨的骨小梁微觀結構。對于所有測試，掃描條件保持相同(分辨率：18 mm;源電壓:65 kV;源電流:385 μA;旋轉步驟:0.7)。每組選取8只大鼠用于Micro-CT測量。在這些區域中，骨小梁由股骨干骺端內側的皮質骨內部限定，且骨小梁區域定義為距離股骨干骺端的生長板約(0.5±2.0)mm。Micro-CT系統中的軟件用于分析骨小梁微觀結構的參數，如骨密度(BMD)、骨體積/總體積(BV / TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。隨后對股骨進行組織學檢測，骨組織在10 % EDTA溶液中脫鈣4～6周，此溶液每周更換一次。待脫鈣滿意后將骨組織浸入乙醇中脫水(70 %過夜，然后濃度分別為80 %、85 %、90 %和95 %，持續2 h，終濃度為100 %)。然后將樣品用二甲苯酚處理并包埋于石蠟中。用蘇木精和伊紅對4 μm厚股骨干骺端切片進行染色。使用配備有Leica DFC310FX數碼相機的Leica DM4000B光學顯微鏡進行觀察和分析。

1.2.3血清學檢測：在處死大鼠前通過心臟穿刺采集血樣。血樣在3 000 r/min，4 ℃下離心15 min，獲得血清標本。血清骨鈣素(OC)水平使用市售的ELISA試劑盒(Takara，Co，Ltd.)檢測。采用TRAPTM酶聯免疫檢測試劑盒(ELISA,IDS，Tyne&Ware，UK)檢測骨吸收標志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP-5b)的水平。所有檢測程序均按照檢測試劑盒的制造商協議執行。

1.2.4蛋白質印跡分析：將新鮮股骨在液氮中冷凍并在RIPA緩沖液[10 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.5%NP-40,0.1%SDS，0.1%脫氧膽酸鹽，1 mmol/L PMSF和2 mmol/L氟化鈉]中均質化，原料琥珀酸鈉，補充有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，St.Louis，MO，USA)和PhosSTOP磷酸酶抑制劑混合物(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)。將含有等量蛋白質的組織裂解物在10 %SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉移到PVDF膜上，將其在PBST中和一抗在4 ℃下封閉孵育過夜。在PBST中洗滌，將膜與二抗一起孵育，最后用增強的化學發光(ECL)系統顯現信號。GAPDH用作內部對照。

1.3 統計學分析

結果以均數±標準差表示，使用Windows版本 SPSS 22.0對進行分析。采用student’t檢驗分析兩組之間的差異。P值<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 維生素E對大鼠骨量的影響

和對照組比較，模型組骨小梁明顯減少，骨密度明顯降低，表明老年大鼠骨流失嚴重；維生素E治療組大鼠BMD明顯高于模型組(P<0.05)。在股骨干骺端中，Micro-CT評估顯示與模型組BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp對比，治療組大鼠具有更高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和更低的Tb.Sp (P<0.05)。見圖1。

圖1 骨小梁Micro-CT掃描結果與定量分析結果注：A:骨小梁三維重建結果；B：BMD；C：Tb.Sp；D：Tb.Th；E：Tb.N；F：BV/TV；a：對照組；b：模型組；c：治療組；Con:對照組；Mod:模型組；Tre:治療組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.1 Micro CT scanning and quantitative analysis of trabecular bone

2.2 HE染色結果分析

對照組大鼠股骨干骺端可見大量骨小梁，骨小梁連接緊密且排列整齊；模型組干骺端只能見到很少量的骨小梁，骨小梁單獨存在，之間幾乎看不到連接，空白地方被大量脂肪空泡所替代；治療組骨小梁組織較對照組明顯增加，骨小梁之間連接疏松，但是較對照組明顯改善。見圖2。

圖2 各組大鼠股骨干骺端HE染色觀察結果注：A：對照組；B：模型組；C：治療組；× 10。Fig.2 HE observation results of femoral metaphysis of rats in each group

2.3 維生素E對大鼠骨代謝的影響

與對照組相比，治療組大鼠血清OC水平顯著升高(P<0.05)，TRACP-5b水平降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 兩組大鼠血清OC和TRACP-5b水平比較注：A:OC;B:TRACP-5b；Con:對照組；Mod:模型組；Tre:治療組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.3 Comparison of serum OC and TRACP-5b levels in two groups of rats

2.4 維生素E對SD大鼠自噬水平的影響

Western印跡分析顯示維生素E治療組大鼠Beclin-1和Atg 5的蛋白質表達更高。此外，維生素E還刺激LC3-II/LC3-I水平的改變(P<0.05)。同時，通過Western印跡證實維生素E處理降低了p62的表達(P<0.05)。所有結果均顯示維生素E對年齡相關自噬水平的下降有保護作用。見圖4。

圖4 WB檢測結果注：A：蛋白質印跡定量檢測結果；B：LC3-II/LC3-I；C：Atg5；D：Beclin-1；E：p62蛋白的表達；Con:對照組；Mod:模型組；Tre:治療組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.4 WB test results

3 討論

本研究使用24月齡雌性大鼠作為研究模型，經過12周維生素E的干預治療，HE和Micro-CT分析結果表明治療組大鼠的骨密度及骨微觀參數顯著優于模型組；血清學的結果表明治療組的成骨細胞活性增加，破骨細胞活性明顯受到抑制。進一步研究產生這種可能性的機制，WB結果表明LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Atg 5的蛋白質表達更高，p62表達顯著降低。這表明骨組織中自噬水平明顯增加，說明維生素E可以通過提高自噬水平來改善骨代謝和骨量。

選取24個月大的雌性SD大鼠作為研究模型，是因為老年雌性SD大鼠經歷著與老年人相當的骨質流失。一些研究[8-9]已經證實，老年雌性SD大鼠可以作為年齡相關性骨丟失的合適動物模型。隨著年齡的增長，骨吸收和骨形成之間的平衡受到干擾，骨吸收過多導致骨質流失[9]。然而，與年齡相關骨丟失的病理生理學的分子機制尚不完全清楚。據報道[10-11]，骨細胞是響應機械和激素刺激的骨重塑過程的主導者。一方面，骨細胞通過下調硬化蛋白來協調成骨細胞的形成，硬化蛋白通過激活Wnt信號傳導是一種有效的骨形成抑制劑[12]；另一方面，在生理和病理條件下，骨細胞通過調節破骨細胞生成的促進劑RANKL的分泌來調節破骨細胞的活性[13]。凋亡的骨細胞被認為是與年齡相關的骨丟失的主要罪魁禍首。骨細胞凋亡導致的骨細胞死亡作為破骨細胞的歸巢信號，從而促進局部骨吸收[14]。此外，凋亡的骨細胞能夠釋放表達RANKL的凋亡小體以募集破骨細胞[15]。因此，維持骨細胞活力的分子途徑可能成為與年齡相關骨丟失的潛在治療劑。本研究使用維生素E作為維持骨細胞活力干預手段，取得較好的療效。

骨細胞可以經歷稱為自噬的細胞穩態機制。自噬被認為是維持細胞活力所必需的，細胞自噬的下降可能導致細胞死亡。以前的研究還報道自噬是一種重要的細胞凋亡保護過程。最近，已經證明自噬是骨細胞中一種主要的保護過程，可以抵抗糖皮質激素的有害影響[5]。此外，在嚙齒動物中也觀察到骨細胞自噬失敗，而自體受損的遺傳小鼠模型顯示骨質減少和骨重建類似于衰老引起的[16]。上述結果表明，細胞自噬可能是保持骨細胞活力的重要機制，從而調節骨重塑。維生素E是脂溶性維生素之一，研究[17]證實其可以增加正常雄性大鼠骨量的作用。維生素E的機制之一是它具有清除自由基和防止氧化損傷的能力[18]。本研究表明在維生素E治療的大鼠中觀察到更高的自噬水平；維生素E治療12周增加了骨細胞中特異性自噬體標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Atg 5表達。此外，維生素E還刺激了骨細胞富集的皮質骨中的LC3轉化。此外，p62在經維生素E治療的大鼠中顯著降低，這表明治療組的自噬活性明顯增加。因此，本研究結果支持維生素E刺激骨細胞中的自噬活性的假設。以前的研究[18]表明，維生素E不僅能夠減少破骨細胞數量，還能阻止破骨細胞的形成。所有上述觀察結果表明，維生素E可以對年齡導致的骨量流失產生潛在影響。

當然，本研究也存在一定的局限性。首先，選取24月齡的雌性大鼠，由于個體的差異，可能影響研究結果；其次，沒有使用陽性對照；最后，本研究中的維生素E只使用一種劑量，這種劑量是否為最佳劑量不得而知。

總的來說，本研究結果表明維生素E治療顯著提高了老年雌性大鼠血清骨鈣素水平、降低了TRACP-5b水平，維生素E對骨重建影響的分子機制尚不清楚，但本研究證實維生素E在老年雌性大鼠中可以起到防止與年齡相關骨丟失的功效，通過增加自噬水平來保護老年雌性大鼠的骨量。