蘆薈素通過激活ERK1/2-Runx 2信號通路介導對去卵巢大鼠骨量流失的保護作用

沙仁高娃 陳華

1.青海大學附屬醫院婦科，青海 西寧 810000 2.青海大學附屬醫院腫瘤婦科，青海 西寧 810000

骨質疏松癥是一種系統性骨骼疾病，其特征是骨量低和骨組織的微結構退化，導致骨骼脆弱和骨折風險增加[1]。骨質疏松癥的主要原因是骨形成和骨吸收之間的不平衡，這是由成骨細胞的失活和破骨細胞活性的增加所致。目前主要預防和治療骨質疏松的藥物有兩種：抗吸收藥和促合成代謝藥。由于雙膦酸鹽類藥物具有減慢骨吸收的功效，因此它們被廣泛用于治療骨質疏松癥，而包括人甲狀旁腺素在內的合成代謝藥物則可刺激骨形成。然而，長期使用這些藥物會具有某些局限性和副作用[2-3]。蘆薈素(LHS)是從常綠多年生植物蘆薈中提取的蒽醌糖基化合物[4]，已被證明具有有效的抗腫瘤、抗炎、抗結腸炎和抗氧化活性[5-6]作用。最近的一項研究[6]發現，LHS可以在MC3T3-E1細胞中促進成骨分化調節因子的表達，例如BMP-2(骨形態發生蛋白2)和Runx 2(Runt相關轉錄因子2)。然而，尚未有LHS對絕經后骨質疏松癥療效的研究。因此，本研究的目的是使用LHS干預觀察其對去卵巢大鼠骨量的影響，并初步探討可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

將30只3月齡的雌性Sprague Dawley(SD)大鼠[(250±30) g，購于北京動物實驗中心)]適應性飼養一周，隨后對30只雌性大鼠進行雙側卵巢切除術(n=20)及假手術(n=10)。手術后大鼠被隨機分為3組(每組10只)：去卵巢組(OVX)、假手術組(Sham)和去卵巢大鼠接受蘆薈素治療組(LHS)；其中LHS組大鼠每天接受50 mg/kg蘆薈素(純度>98%，購于Sigma-Aldrich)治療，其余組大鼠接受生理鹽水治療。治療12周后，處死所有動物收集雙側股骨進行檢測。

1.2 方法

1.2.1Micro-CT檢測：使用SkyScan 1076型號Micro-CT(SkyScan,Aartselaar,Belgium)對大鼠左側股骨遠端的松質骨骨小梁進行3D分析。Micro-CT設備包括一個焦點為9 μm的微型X射線管，可產生由電荷耦合器件陣列和轉臺檢測到的扇形束，并可以沿軸向自動移動。選擇能量和強度分別等于40 kVp和250 μA。在原始3D圖像上，直接根據感興趣的區域(VOI)確定形態計量指標，該體積僅限于直徑為1.5 mm的內圓柱和整個股骨遠端松質骨骨小梁，不包括距骺線2 mm遠端的區域。通過計算以下3D形態參數來描述骨骼質量和微觀結構：骨密度(BMD，g/cm2)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁體積分數(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.2.2組織學檢測：將右側股骨在中性緩沖的10 %甲醛溶液中固定5 d，并在10 %乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)中脫鈣1個月，然后用手術刀從矢狀面中段分開并包埋在石蠟中。最后將樣品在矢狀面切成5 μm厚的切片，放在顯微鏡載玻片上，并用Van Gieson(VG)染色以進行光學顯微鏡檢查。

1.2.3生物力學評估：使用Instron 4302系統對左側股骨(每組n=5)進行三點彎曲實驗評估。將股骨放在材料檢測機支架上，兩個支架之間的距離為1.5 mm，測試區域定義為股骨的最中央部分。以2 mm/min的速度施加壓縮載荷直至骨折。通過連接的計算機監控骨折時的最大載荷(N)和彈性模量(mm2)的數據。

1.2.4蛋白印記檢測：用RIPA緩沖液(Thermo Fisher Science)制備股骨遠端骨組織裂解物，然后12 000g離心15 min以去除組織碎片。用BCA蛋白分析試劑盒(Beyotime)測定蛋白質濃度。在10 %或12 %十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠上分離總蛋白(20 μg)，并轉移到聚偏氟乙烯膜上。在含有5 %脫脂奶粉的TBS中封閉1 h，然后在4 ℃下與p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN (購于Cell Signing Technology)一抗體孵育過夜，最后用TBST清洗膜，并與二次抗體孵育1 h。使用ECL試劑 (Thermo Fisher Science)檢測抗體反應條帶，使用ImageJ軟件定量分析條帶強度。

1.3 統計學分析

統計分析采用單因素方差分析(ANOVA)，然后進行Student’t檢驗。結果使用均數±標準差(SD)表示。P<0.05表示比較差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Micro-CT結果分析

股骨干骺端骨小梁二維圖像如圖1 A所示。股骨干骺端的微觀參數如圖1B～圖1F所示。OVX組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。LHS組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖1 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果A：股骨干骺端骨小梁二維圖像；B：骨密度；C：Tb.Th；D：Tb.N；E：Tb.Sp；F：BV/TV。注：與Sham組相比，*P<0.05;與OVX組相比，#P<0.05。Fig.1 Micro-CT test results of the femoral metaphysis in the three groups of rats

2.2 股骨組織病理學

股骨干骺端骨小梁組織切片如圖2所示，Sham組大鼠股骨干骺端骨小梁致密，骨小梁網狀結構正常；OVX組大鼠骨小梁疏松變薄，導致骨小梁間隙變寬；LHS組大鼠的骨小梁數量和連接增加明顯，表現出明顯的結構恢復。

圖2 三組股骨的組織病理學a:Sham組;b:OVX組;c:LHS組。注：VG染色(放大倍數，×10)。Fig.2 Histopathology of femurs in the three groups

2.3 股骨的生物力學變化

股骨三點彎曲試驗表明，Sham組的最大載荷和彈性模量均高于OVX組，兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，LHS組的最大載荷和彈性模量均高于OVX組(P<0.05)，見圖3。

圖3 右股骨的三點彎曲試驗結果注：與Sham組相比，*P<0.05;與OVX組相比，#P<0.05。Fig.3 Three-point bending test results of the right femur of rats

2.4 WB檢測結果

圖4 WB檢測結果A:WB檢測各種蛋白的相對表達;B:RUNX 2;C:OCN;D:OPN;E:ALP;F:Erk1/2;G:p-Erk1/2。注：與Sham組相比，*P<0.05;與OVX組相比，#P<0.05。Fig.4 WB test results

和Sham組比較，OVX組p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表達水平明顯下調，比較差異有統計學意義(P<0.05)。和OVX組比較，LHS組p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表達水平明顯上調，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

蘆薈素不僅具有促進傷口愈合的作用，還具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗過敏作用[5]。最近的研究[4]表明，蘆薈素是RANKL誘導的RAW264.7細胞中破骨細胞生成和骨吸收的有效抑制劑，還可以通過MAPK和Wnt途徑增強MC3T3-E1細胞的成骨性[4]。但是，蘆薈素對絕經后骨質疏松癥的作用目前尚不清楚。本研究的目的是研究蘆薈素對去卵巢大鼠股骨骨強度、骨密度和骨小梁微觀結構的影響。

Micro-CT結果顯示，OVX組的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th最低，而TbSp最高。而蘆薈素可以顯著改善BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp。組織病理結果進一步證實了蘆薈素可以改善骨小梁的微結構。以上結果表明，蘆薈素可以顯著增加去卵巢雌性大鼠的骨量，并改善其骨小梁的微結構。三點彎曲試驗結果表明，去卵巢誘導的骨質疏松大鼠最大負荷和彈性模量均明顯降低，蘆薈素可以顯著改善上述指標，并可以顯著改善股骨的生物力學性能、增強其機械強度。

本研究進一步通過蛋白印記檢測骨組織p-Erk1/2、Erk1/2、ALP、RUNX 2、OCN和OPN表達情況。在一項使用MC3T3-E1細胞系的研究[7]中，蘆薈素在初始階段通過增加ALP的產生并在后期階段通過礦化來刺激成骨細胞的誘導過程。本研究表明蘆薈素能促進骨組織中成骨相關基因(ALP、OCN和OPN)的表達。RUNX 2是成骨細胞分化和骨形成的關鍵調節劑，在骨髓間充質干細胞進入成骨細胞譜系的過程中起著重要作用；當受到連續的機械刺激或用熱激蛋白70處理時，間充質干細胞可以被誘導成骨，這依賴于ERK1/2-Runx 2信號通路[8]。據報道，ERK1/2通路參與成骨的調節，成骨細胞分化過程中RUNX 2的穩定需要ERK1/2磷酸化[9]。為了確認ERK1/2途徑是否參與蘆薈素介導對去卵巢大鼠骨量保護作用，本研究進一步觀察了蘆薈素對骨組織ERK1/2表達情況。蛋白質印跡結果表明，在蘆薈素干預的情況下，p-ERK1/2和RUNX 2表達水平顯著上調。這些數據表明蘆薈素能促進ERK1/2的磷酸化，進而上調轉錄因子RUNX 2的表達，從而促進成骨作用。

總之，本研究首次證明了蘆薈素可以通過ERK1/2-Runx2信號通路促進去卵巢大鼠成骨，防止去卵巢大鼠骨量、骨密度和骨強度的降低。蘆薈素可能成為治療絕經后骨質疏松癥的潛在藥物。