二甲雙胍對地塞米松作用下SD大鼠骨密度的影響及可能的機制

丁欽佩 張書 郭昕彤 梁敏

廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧530021

糖皮質激素(glucocorticoids,GCs)是臨床上廣泛使用的一類藥物，長期使用會產生嚴重的副作用，包括糖皮質激素性骨質疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)[1]。GIOP已成為繼發性骨質疏松中最常見的類型。雙膦酸鹽類藥物是治療GIOP的一線用藥，其作用機制主要為抑制骨吸收，長期應用會導致骨微損傷蓄積[2]。因此臨床上迫切需要新的藥物來治療GIOP。二甲雙胍為臨床上治療2型糖尿病的一線用藥。但二甲雙胍對骨骼的影響仍有爭議[3]。本課題組前期的研究[4]發現，二甲雙胍能夠提高SD大鼠的骨密度(bone mineral density,BMD)。本次研究旨在探討不同干預劑量和時間的二甲雙胍對地塞米松作用下SD大鼠BMD的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

72只SPF級3月齡雌性SD大鼠，體重(240±10) g，購買于廣西醫科大學實驗中心，合格證號：SCXK桂2014-0002。大鼠分籠喂養，每籠不超過6只。飼養條件：室溫環境，空氣流通，標準顆粒飼料專人喂養，自由進水攝食。地塞米松磷酸鈉注射液購自天津金耀藥業有限公司；鹽酸二甲雙胍購自美侖生物；水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠；大鼠I型膠原C端肽(CTX-I)及骨鈣素(OCN)酶聯免疫試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.2 方法

大鼠適應性喂養1周后隨機分為6組(每組12只)：對照組、地塞米松組、二甲雙胍100(Met 100)、200(Met 200)、300(Met 300)、500(Met 500)mg組。對照組每周肌內注射生理鹽水2次，每天生理鹽水灌胃1次；地塞米松組每周肌內注射5 mg/kg的地塞米松2次，每天生理鹽水灌胃1次；各二甲雙胍組每周均肌內注射5 mg/kg的地塞米松2次，每天分別給予100、200、300、500 mg/kg的二甲雙胍灌胃1次。藥物干預12周，每2周測體重1次并調整藥物用量。在實驗前及藥物干預后4、8、12周，使用Lunar公司的PLODIGY型雙能X線骨密度儀(附帶小動物軟件)測定大鼠全身BMD及體成分。測量前用10 %的水合氯醛依照3 mL/kg的用量進行腹腔注射麻醉。在實驗結束處死大鼠前，行腹主動脈取血，離心后取上清。部分血樣用來檢測CTX-I及OCN，嚴格依照酶聯免疫試劑盒說明書進行操作。另一部分血樣送至廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，使用全自動生化分析儀檢測血鈣、血磷、堿性磷酸酶(ALP)、血糖、總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠全身BMD的變化

藥物干預前及干預4周時，各組間的BMD比較差異無統計學意義(均P>0.05)。干預8周時，地塞米松組、Met 200、Met 300及Met 500組BMD均低于對照組(均P<0.05)；Met 100組BMD低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)；各地塞米松聯合二甲雙胍組與地塞米松組相比，BMD無統計學的差異(均P>0.05)。干預12周時，地塞米松組和各地塞米松聯合二甲雙胍組的BMD均低于對照組(均P<0.05)；Met 100、Met 200組的BMD均高于地塞米松組及Met 500組(均P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠不同時間點全身骨密度的比較Table 1 Comparison of total bone mineral density at different time points among six

2.2 大鼠全身脂肪組織含量的變化

干預前，各組間脂肪組織含量比較差異無統計學意義(P>0.05)。干預4、8及12周時，地塞米松組和各地塞米松聯合二甲雙胍組的脂肪含量均低于對照組(均P<0.05)；但各地塞米松聯合二甲雙胍組與地塞米松組相比，脂肪組織含量比較差異無統計學意義(均P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠不同時間點全身脂肪組織含量的比較Table 2 Comparison of total fat mass at different time points among six

2.3 大鼠全身肌肉組織含量的變化

干預前，各組肌肉組織的含量比較差異無統計學意義(P>0.05)。干預4、8、12周，地塞米松組和各地塞米松聯合二甲雙胍組的肌肉組織含量均低于對照組(均P<0.05)。干預4周，Met 100、Met 300組及Met 500組的肌肉組織含量均低于地塞米松組(均P<0.05)；Met 200組的肌肉組織含量高于Met 500組(P<0.05)。干預8周，Met 200組的肌肉組織含量高于地塞米松組、Met 500組及Met 100組(均P<0.05)。干預12周，Met 200組的肌肉組織含量高于地塞米松組及Met 500組(均P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠不同時間點全身肌肉組織含量的比較Table 3 Comparison of total lean mass at different time points among six groups (g,

2.4 大鼠體重的變化

干預前，6組之間的體重比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。在干預12周的過程中，對照組(control)體重逐漸上升，而其余各組體重較穩定并呈逐漸下降趨勢。干預2周，Met 500組體重低于對照組(P<0.05)。干預4周至12周，各時間點地塞米松組(dex)及各地塞米松聯合二甲雙胍組的體重均低于對照組(均P<0.05)；其余各組在各時間點體重比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。見圖1。

圖1 各組在12周實驗過程中體重的變化情況Fig.1 Body weight changes of six groups during the 12-weeks experimental period

2.5 大鼠血CTX-I和OCN的變化

與對照組(control)相比，地塞米松組(dex)、Met300、Met 500組的CTX-I顯著升高(均P<0.05)；與地塞米松組相比，Met 100、Met 200及Met 300組的CTX-I顯著降低(均P<0.05)；Met 100及Met 200組的CTX-I均低于Met 500組(均P<0.05)。除Met 100組外，其余各組的OCN均低于對照組(均P<0.05)；與地塞米松組相比，Met 100、Met 200及Met 300組的OCN均升高(均P<0.05)；Met 200、Met 300 及Met 500組的OCN均低于Met 100組(均P<0.05)。見圖2。

圖2 血CTX-I和OCN濃度注：a：CTX-I；b：OCN。與對照組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，&P<0.05；與Met 500組比較，#P<0.05；與Met 100組比較，ΔP<0.05。Fig.2 The serum concentration of CTX-I and OCN

2.6 大鼠血生化指標的變化

Met 300組的血鈣低于Met 500組(P<0.05)，其余各組之間血鈣無差異(均P>0.05)。各組間血磷比較差異無統計學意義(P>0.05)。地塞米松組(dex)、Met 200、Met 300及Met 500組的ALP均低于對照組(control)(均P<0.05)；Met 100、Met 200及Met 300組的ALP均高于地塞米松組(均P<0.05)；Met 100組及Met 300組的ALP高于Met 500組(均P<0.05)；Met 200組的ALP低于Met 100組(P<0.05)。地塞米松組、Met 300組及Met 500組的血糖均高于對照組(均P<0.05)；各地塞米松聯合二甲雙胍干預組的血糖與地塞米松組相比，比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。地塞米松組和各地塞米松聯合二甲雙胍組的CHO及HDL-C均低于對照組(均P<0.05)；各地塞米松聯合二甲雙胍干預組的CHO、HDL-C與地塞米松組相比，比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。地塞米松組的TG比對照組高(P<0.05)；各地塞米松聯合二甲雙胍干預組的TG與地塞米松組相比，比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。各組間LDL-C比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 血生化指標的濃度注：a：血鈣；b：血磷；c：ALP；d：血糖；e：CHO；f：TG；g：HDL-C；h：LDL-C。與對照組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，&P<0.05；與Met 500組比較，#P<0.05；與Met 100組比較，ΔP<0.05。Fig.3 The serum concentration of biochemical indicators

3 討論

本研究發現二甲雙胍可以提高地塞米松作用下SD大鼠的BMD，與Zhao等[5]的結論一致。同時，本研究也發現二甲雙胍提高地塞米松作用下SD大鼠的BMD與其干預的時間、劑量有關。一定劑量的二甲雙胍干預一定的時間，可以改善地塞米松作用下SD大鼠的BMD。隨著二甲雙胍劑量的增加，SD大鼠的BMD反而降低，提示需要準確地把握二甲雙胍劑量和作用時間才能發揮其對骨骼的有利作用。

地塞米松和二甲雙胍均可影響體重及體成分(包括脂肪組織及肌肉組織等)[6-7]。研究[8-10]表明體重及體成分與BMD密切相關。高體重可增加作用于骨骼的承重性外力，進而提高BMD[8,11]。肌肉組織和脂肪組織構成了體重的主要成分，肌肉組織與骨量正相關，而脂肪組織與骨量的關系存在爭議[8]。本研究顯示，干預12周后，各組大鼠之間體重及體成分的變化趨勢與BMD的變化并不一致，表明二甲雙胍提高地塞米松作用下SD大鼠BMD的作用可能不依賴于體重及體成分改變。地塞米松可干擾正常的糖脂代謝，導致血糖升高及血脂紊亂[7]。高血糖可通過多種途徑損害正常的骨代謝，加速骨量的丟失[12]。血脂水平與骨質疏松也密切相關[13]。本研究顯示，地塞米松聯合二甲雙胍干預組與單用地塞米松組相比，血糖、血脂水平比較差異無統計學意義。這表明二甲雙胍對抗地塞米松介導的骨質疏松作用可能與其對糖脂代謝的作用無關。

GIOP的發生機制包括抑制成骨細胞的增殖及分化，促進成骨細胞及骨細胞的凋亡，延長破骨細胞的壽命及活性等，最終使骨形成降低，骨吸收增加[1]。研究[14]顯示，二甲雙胍可通過經典的AMPK通路誘導成骨細胞增殖、分化及礦化，減少成骨細胞凋亡，也可通過上調骨保護素表達及下調核因子κB配體來抑制破骨細胞活性及分化。骨轉換標志物(包括骨吸收和骨形成標志物)是骨骼本身的代謝產物，代表全身骨骼的動態狀況[15]。與雙能X線測量的BMD相比，骨轉換標志物在反映骨量變化方面更加敏感。本研究發現，地塞米松可增加骨吸收標志物CTX-I水平，降低骨形成標志物OCN及ALP水平，而地塞米松聯合Met 100、Met 200及Met 300組可部分逆轉地塞米松所致的骨吸收增加和骨形成減少，這與Zhao等[5]結論一致。二甲雙胍通過增加骨形成和抑制骨吸收改善骨重構，減輕地塞米松造成的骨結構損害，減少骨量丟失，進而抵抗地塞米松造成的BMD下降。此外，GCs可通過抑制腸鈣、磷吸收，減少尿鈣重吸收等間接作用導致骨質疏松[1]。但本研究顯示各組與地塞米松組之間的血鈣、磷水平比較差異無統計學意義。一方面是因為血鈣、磷容易受各種因素，如血清總蛋白水平、飲食等影響，另一方面可能與單次測量的血鈣、磷水平并不能充分反映體內鈣、磷代謝的真實情況有關，測定24 h的尿鈣、磷可能更有意義。

臨床上二甲雙胍的療效與劑量有關，在每天500～2 000 mg的劑量范圍內，其效果呈現劑量依賴效應，繼續增加劑量其療效反而降低[16]。在本研究中，干預12周后，二甲雙胍對糖、脂及骨代謝指標的影響并沒有呈現劑量依賴性，這可能與給藥劑量[大鼠200 mg/(kg·d)約相當于人類2 000 mg/(70 kg·d)[17]]、給藥頻率、給藥方式及種屬差異等有關。提示在后續的研究中，需要優化給藥劑量、頻率、方式等，必要時監測二甲雙胍的血藥濃度，以深入探討二甲雙胍對糖、脂及骨代謝指標的影響與其抗骨質疏松作用的相關性。

綜上，本研究顯示，二甲雙胍可能通過增加骨形成和抑制骨吸收來改善地塞米松作用下SD大鼠的BMD，這一作用不依賴于體重、體成分及糖脂代謝的改變，主要與二甲雙胍干預的時間和劑量有關。未來二甲雙胍有望成為治療GIOP的新藥。