面向組織工程實(shí)驗(yàn)的3D生物打印機(jī)研制

高志剛， 羅 勇， 鄧權(quán)鋒， 李曉瑞， 李廣哲

（大連理工大學(xué)國(guó)家級(jí)化工綜合實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，遼寧大連116024）

0 引 言

生物打印是近幾年來(lái)在組織工程領(lǐng)域的新興技術(shù)，是根據(jù)分散堆積成形原理，以活細(xì)胞、生物活性因子為原材料，設(shè)計(jì)打印出具有生物活性的人工器官或組織結(jié)構(gòu)的技術(shù)，融合了制造技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)等學(xué)科［1-3］。生物打印與傳統(tǒng)的制造方法（如圖案法、模具法等）相比，其主要的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：不依賴(lài)模具而進(jìn)行生物體的制造，不受傳統(tǒng)加工的限制，可以構(gòu)建復(fù)雜的結(jié)構(gòu)體，將多種細(xì)胞精準(zhǔn)空間排列，不產(chǎn)生廢料而做到節(jié)省材料，不占用空間，節(jié)約時(shí)間等方面［4-6］。

生物3D打印機(jī)的搭建組裝是生物制造的重要條件，但也面臨著很多挑戰(zhàn)，如打印機(jī)構(gòu)建、打印方式確定和打印后組織的評(píng)價(jià)都要結(jié)合活性細(xì)胞性質(zhì)而設(shè)計(jì)，涵蓋細(xì)胞學(xué)、材料學(xué)、機(jī)械自動(dòng)化等諸多學(xué)科的知識(shí)。目前生物3D 打印機(jī)的搭建技術(shù)并不十分成熟，由于打印的細(xì)胞種類(lèi)、生物墨水材料和打印后驗(yàn)證手段不同，全球僅有美國(guó)、德國(guó)等少數(shù)幾個(gè)國(guó)家有能力研發(fā)生產(chǎn)商品化的生物打印機(jī)，但受制于價(jià)格較高及軟硬件參數(shù)受專(zhuān)利保護(hù)無(wú)法修改，商品化的生物打印機(jī)在國(guó)內(nèi)還未得到大量的應(yīng)用［7］。為了開(kāi)發(fā)更加實(shí)用生物打印機(jī)，促進(jìn)生物打印技術(shù)在科研和教育領(lǐng)域的發(fā)展，本文構(gòu)造了可以進(jìn)行低溫控制、集成化、體積小的擠壓型生物打印機(jī)，并對(duì)打印參數(shù)和效果進(jìn)行了測(cè)試，可完全滿(mǎn)足生物打印要求。

1 生物打印原理

逐層累加細(xì)胞打印組織的需求在醫(yī)藥生物發(fā)展中已逐漸擴(kuò)大，但打印細(xì)胞和組織需要較高性能的打印平臺(tái)為細(xì)胞無(wú)菌增殖創(chuàng)造條件；同時(shí)生物打印還需要具有生物相容性的遞送介質(zhì)，可以按計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)建模的要求打印出具體形狀［8］。因此生物打印主要涉及打印模式的搭建與兼容適配，打印材料的性質(zhì)穩(wěn)定易加工，且具有較好的生物相容性。目前生物打印機(jī)根據(jù)打印原理分別是擠出式、噴墨式和激光式生物打印機(jī)。

1.1 基于激光技術(shù)

基于激光技術(shù)的生物打印機(jī)利用激光能量將細(xì)胞從捐助者的幻燈片沉積到接收器幻燈片，而不需要噴嘴，該技術(shù)源于激光誘導(dǎo)方位轉(zhuǎn)移原理，2001 年由密歇根理工大Odde 教授提出，但是該技術(shù)打印的生物墨水要求黏度范圍在1 ～300 mPa／s。該技術(shù)生物打印精度高，但打印過(guò)程復(fù)雜容易出現(xiàn)打印故障，且打印成本很高［9-11］。

1.2 基于噴墨技術(shù)

基于噴墨方式的生物打印機(jī)利用熱壓或超聲驅(qū)動(dòng)機(jī)制以高通量方式沉積細(xì)胞懸液液滴；最初的噴墨式生物打印被命名為“細(xì)胞劃線”，因?yàn)槎S打印的墨水的液滴大小類(lèi)似于生物制劑。較早出現(xiàn)的噴墨打印平臺(tái)只可打印黏度為10 mPa／s 以下的生物墨水。若黏度較大則對(duì)擠壓力要求更多，會(huì)傷害細(xì)胞膜，故要求細(xì)胞密度小于107個(gè)／mL，打印過(guò)程采用的光交聯(lián)方式可能會(huì)損傷細(xì)胞，且打印時(shí)間較長(zhǎng)［12］。

1.3 基于擠出技術(shù)

基于擠壓方式的生物打印機(jī)使用機(jī)械或氣動(dòng)驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，以擠出生物墨水細(xì)絲的形式逐層沉積細(xì)胞，打印機(jī)硬件系統(tǒng)由擠出動(dòng)力系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)等組成?？纱蛴〖?xì)胞高密度的生物墨水，黏度范圍為（3 ～6）×102Pa／s 的生物相容性材料均適用于擠壓式生物3D打印機(jī)。但細(xì)胞存活率稍低，只有40% ～80%，且隨著擠壓力變大和注射器針口直徑的縮小，細(xì)胞活性會(huì)相對(duì)降低低［13-14］。目前擠壓式生物打印機(jī)主要分為五類(lèi)：常規(guī)的擠壓生物打印機(jī)；具有較高運(yùn)動(dòng)自由度的擠壓生物打印機(jī)；支持生物細(xì)胞基質(zhì)過(guò)程的生物打印機(jī)；支持生物打印細(xì)胞聚集體的生物打印機(jī)；支持其他生物打印模式的生物打印機(jī)。

2 生物打印機(jī)設(shè)計(jì)與搭建

本文所搭建的擠出型打印機(jī)如圖1 所示，主要由模型設(shè)計(jì)軟件、中央控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、打印底板、打印頭和三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)六部分組成。

圖1 擠出型3D生物打印機(jī)系統(tǒng)構(gòu)建

2.1 模型設(shè)計(jì)軟件

三維設(shè)計(jì)軟件主要用到Autodesk 3DS Max 軟件和Repetier-Host 切片軟件，前者用于模型構(gòu)建，而后者是3D 打印技術(shù)的核心軟件，通過(guò)把三維的立體模型分成無(wú)數(shù)個(gè)層層的二維平面，再由打印機(jī)還原，即使用軟件實(shí)現(xiàn)點(diǎn)和線向空間中的坐標(biāo)的構(gòu)建的轉(zhuǎn)化，就是常說(shuō)的G 代碼。切片軟件對(duì)打印速度、填充效率和打印層次數(shù)等相關(guān)參數(shù)都可以做到數(shù)字化可控，以及確定的G 代碼就可以實(shí)現(xiàn)三維打印。

2.2 控制系統(tǒng)

3D 打印機(jī)中最關(guān)鍵的運(yùn)行部件是單片機(jī)，如常見(jiàn)的mage2560 ＋ramps1.4 分體板、ultimaker2 主板、3dymy ramps plus2。本打印機(jī)控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)如圖2 所示，選擇mage2560 ＋ramps1.4 分體板作為核心控制器，設(shè)置16 細(xì)分的電機(jī)細(xì)分?jǐn)?shù)。與此同時(shí)，為了達(dá)到提高人機(jī)交互和可視化控制的效率的目標(biāo)，打印機(jī)還選擇在工業(yè)中常用的電阻式觸摸屏，從而使得打印機(jī)進(jìn)行離線操作。

2.3 溫度控制系統(tǒng)

溫度系統(tǒng)作為生物打印機(jī)主要控制單元，決定著生物墨水的打印性質(zhì)和生物相容性是否適用于細(xì)胞三維培養(yǎng)。根據(jù)目前商用打印機(jī)調(diào)研得出，溫控主要由加熱片及氣源泵組成，較為笨重且費(fèi)用占比過(guò)大。本打印機(jī)設(shè)計(jì)主要從溫度集成入手，根據(jù)添加散熱片和半導(dǎo)體加熱片的途徑，在主機(jī)內(nèi)進(jìn)行集成，從控制臺(tái)進(jìn)行溫控設(shè)置，為避免切片軟件設(shè)計(jì)時(shí)的溫控參數(shù)對(duì)改進(jìn)后的控制臺(tái)溫度影響，在兩個(gè)接入面板將溫控信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行了焊點(diǎn)阻斷，調(diào)試出了合理的擠出頭和底板溫控系統(tǒng)。

圖2 生物打印控制系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

2.4 打印底板

打印底板可以進(jìn)行十分精細(xì)的調(diào)節(jié)，達(dá)到調(diào)節(jié)打印噴頭和底板間的距離的作用，如圖3 所示。考慮生物墨水特性，用半導(dǎo)體制冷技術(shù)在底板下增加一套控溫系統(tǒng)，底板上裝有凹槽，可直接將細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)貼到凹槽中固定的玻璃片上。

圖3 打印底板實(shí)物圖

2.5 打印噴頭

生物打印機(jī)的打印噴頭稱(chēng)為注射器的“注射泵”，注射器擠出生物材料，再受到了滑塊的運(yùn)動(dòng)刺激。目前存在兩種擠壓動(dòng)力，即氣動(dòng)擠壓和電動(dòng)擠壓。氣動(dòng)擠壓頭用高壓氣體促使凝膠運(yùn)動(dòng)，組成系統(tǒng)要求一定的氣密性和及時(shí)的空氣過(guò)濾，組成系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，氣動(dòng)泵，調(diào)壓閥，電磁開(kāi)關(guān)，劣勢(shì)明顯，匹配的速度慢，打印精度低等。

因此，本機(jī)選擇使用電動(dòng)式擠出頭，與注射泵原理類(lèi)似，在注射器里添加生物墨水，受到來(lái)自步進(jìn)電動(dòng)機(jī)或伺服電動(dòng)機(jī)的驅(qū)動(dòng)，使得生物墨水精密準(zhǔn)確地?cái)D出，這種系統(tǒng)具有超高的精度、超快的反應(yīng)速度、較小的個(gè)體等優(yōu)勢(shì)。圖4 中展示的是對(duì)具有溫度控制能力的打印頭的設(shè)計(jì)，打印噴頭設(shè)計(jì)了溫度控制模塊，可控溫度范圍為5 ～100 ℃。同時(shí)圖4（c）中注射器外設(shè)計(jì)夾套，夾套配有半導(dǎo)體制冷片、散熱片、散熱風(fēng)扇等控制注射器溫度，并以此調(diào)節(jié)生物墨水的黏彈性。

圖4 生物打印噴頭設(shè)計(jì)圖（（a）夾套設(shè)計(jì)CAD 圖，（b）打印頭溫控系統(tǒng)圖，（c）打印噴頭實(shí)物圖）

2.6 三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)

三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)是3D 打印機(jī)中的重要組成部分，主要存在的結(jié)構(gòu)類(lèi)型有并聯(lián)結(jié)構(gòu)型、Prusa i3 型和串聯(lián)結(jié)構(gòu)型等，可以對(duì)噴頭在空間的移動(dòng)的一致性進(jìn)行共同協(xié)調(diào)。運(yùn)動(dòng)平臺(tái)主要由X、Y、Z 3 個(gè)主傳動(dòng)軸和E1、E2 兩個(gè)步進(jìn)電軸組成，用電鉆在打印機(jī)主骨架橫梁中點(diǎn)鉆出X、Y、Z 3 個(gè)方向的垂直圓孔，務(wù)必保持重心一致以保持后續(xù)運(yùn)動(dòng)平衡，其連接主要靠螺帽固定，內(nèi)側(cè)套好3 個(gè)42 步進(jìn)電動(dòng)機(jī)和彈簧片，對(duì)線性軸承模組進(jìn)行固定，同時(shí)在X、Y、Z軸分別添加了可調(diào)節(jié)的限位開(kāi)關(guān)，便于根據(jù)不同要求調(diào)整打印機(jī)高度。

3 生物打印人耳軟骨細(xì)胞

3.1 生物墨水制備

如何利用打印機(jī)打印具有良好組織結(jié)構(gòu)的生物模型，性能完善的生物墨水是必須條件。根據(jù)生物墨水要求的機(jī)械性能、生物相容性、黏彈性、剪切變稀性等特點(diǎn)［15-16］，確定了基于黏土、海藻酸鈉、硫酸鈣交聯(lián)劑、硅橡膠黏合劑、固化劑這5 種原料的生物墨水配制方式，本文就這5 種生物墨水原料的配比進(jìn)行了探索，其中海藻酸鈉與交聯(lián)劑的配比為2∶1，硅橡膠與固化劑比例為20∶1。在此前條件下，要保證實(shí)驗(yàn)?zāi)偭坎怀^(guò)5 mL，依據(jù)打印出的耳朵模型結(jié)構(gòu)保存時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)配比是否完善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示，由此確定生物墨水配比為3 g 黏土、2 mL 海藻酸鈉、1 mL 硫酸鈣交聯(lián)劑、4 mL硅橡膠、0.2 mL固化劑。

3.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)選擇來(lái)自北納創(chuàng)聯(lián)公司的C28／I2 細(xì)胞，屬于人正常軟骨細(xì)胞，該細(xì)胞的培養(yǎng)液為90 %高糖DMEM／F-12 ＋10%FBS ＋1%雙抗。

表1 生物墨水主要成分配比

人耳模型打印一般在細(xì)胞消化后，將培養(yǎng)2 d 鋪滿(mǎn)皿底的細(xì)胞消化下來(lái)轉(zhuǎn)移入5 mL 離心管中，在1 000 r／min 轉(zhuǎn)速下離心4 min，離心后將上層細(xì)胞清液吸取，加入200 μL細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，制成細(xì)胞懸液。吸取2 mL配制好的生物墨水置于5 mL 注射器中，將200 μL細(xì)胞懸液滴入注射器中，反復(fù)吹打混勻100 次以上，使生物墨水混合均勻。打開(kāi)溫度控制系統(tǒng)，設(shè)置為底板13 ℃，注射器夾套溫度15 ℃，安裝好注射器冷卻15 min，調(diào)節(jié)注射器回原點(diǎn)，旋下Z 軸將注射器中的墨水?dāng)D出少許，調(diào)底板高度距針頭約0.5 mm，選擇文件模型進(jìn)行打印。

人耳模型打印完成后連同玻璃片取出，滴加配制好的氯化鈣溶液進(jìn)行交聯(lián)15 min，同時(shí)培養(yǎng)皿中加入8 mL無(wú)血清的空培養(yǎng)液和2 mL 氯化鈣溶液，將交聯(lián)后的人耳模型轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于搖床上搖動(dòng)5 min，將皿內(nèi)液體吸去，再加入10 mL 空培養(yǎng)液搖床搖動(dòng)5 min，反復(fù)3 次。最終吸棄小皿里的空培養(yǎng)液，加入預(yù)先配制好的細(xì)胞培養(yǎng)液，沒(méi)過(guò)打印出耳朵，放于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3.3 打印軟骨細(xì)胞活性表征

打印好的人耳組織模型主要從外觀結(jié)構(gòu)和熒光染色進(jìn)行表征。外觀結(jié)構(gòu)每隔2 d 觀察人耳模型結(jié)構(gòu)，查看在培養(yǎng)液下的外觀狀態(tài)并進(jìn)行拍照對(duì)比，如圖5所示，打印后的形狀維持時(shí)間可達(dá)10 d。

圖5 打印含有軟骨細(xì)胞的人耳模型10 d內(nèi)觀察圖

熒光染色主要考察三維培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞的活死，主要用到鈣黃綠素和碘化吡啶作為染色劑進(jìn)行活死檢測(cè)，首先將染色劑在避光的條件下高速離心，取樣品切碎幾個(gè)斷面于培養(yǎng)皿中吸取300 μL培養(yǎng)液，分別加入兩種染色劑各1.5 μL，注意每次一定要更換槍頭，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min 后進(jìn)行漂洗，加入空培養(yǎng)液1 ～2 mL，在搖床上搖動(dòng)5 min，反復(fù)3 次，貼上封口膜轉(zhuǎn)移入細(xì)胞間進(jìn)行熒光拍照，結(jié)果如圖6 所示。可以發(fā)現(xiàn)生物打印后的軟骨細(xì)胞在三維模型中能保持正常增殖功能，且隨著時(shí)間增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。

圖6 活細(xì)胞熒光染色結(jié)果圖

4 結(jié) 語(yǔ)

隨著新的打印技術(shù)和生物材料不斷應(yīng)用，使得生物打印技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟。與此同時(shí)受制于打印機(jī)價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，使得該技術(shù)普遍推廣較為困難。本文研制了一個(gè)擠出型生物打印機(jī)并成功構(gòu)建出含有軟骨細(xì)胞的人耳三維模型，打印后的細(xì)胞展現(xiàn)出良好生物活性，為后續(xù)生物工程、組織工程和藥學(xué)等專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供了良好的借鑒。該生物打印機(jī)具有較高的集成性，操作簡(jiǎn)便，價(jià)格便宜，并基于溫敏性生物墨水實(shí)現(xiàn)打印。通過(guò)該生物打印機(jī)的研制，能夠促進(jìn)了生物打印技術(shù)在高等教育教學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣。