基于網絡藥理學結合細胞和分子實驗探究紫草素抗鼻咽癌的作用機制

郭興喆，白先愚，楊萌哲，成南南，徐寧，周守常，覃柳潔，焦愛軍

（1.廣西醫科大學 生命科學研究院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學 生物化學與分子生物學教研室，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學 藥學院，廣西 南寧 530021）

0 引言

在我國，鼻咽癌是南方地區是最常見的惡性腫瘤之一[1]，全世界有超半數的鼻咽癌患者發生在中國，在西方學術界有“中國癌”之稱[2]。在廣西，鼻咽癌是排位在第四位的惡性腫瘤，近些年來，發病年齡趨于年輕化。醫院就診患者中大多數是中晚期，治療效果不好，20年前的5年生存率只有60%左右[3]。對于局部進展期鼻咽癌患者，目前以順鉑為基礎同步進行放化療作為標準治療。然而在化療過程中，部分患者對化療藥物耐受性差需降低化療劑量以降低藥物毒性甚至暫停治療。為了保證能夠按時完成治療，需探索新的同步化療藥物，減少治療期間的毒副反應的同時保證療效[4]。

紫草素是一種天然有機物，化學式為C16H16O5，英文名稱為Shikonin，是從天然植物宗阜根中提煉的紫紅色萘醌類化合物，具有滅菌、消炎、抗癌等作用。臨床用于治療肝硬化伴腹水以及急、慢性肝炎，局部還可應用修復傷口，促進創面瘢痕形成。有研究表明紫草素介導的PD-L1降解是通過下調NF-κB/CSN5和NF-κB/STAT3信號通路相關蛋白表達達到抗胰腺癌的作用[5]。這表明紫草素是良好的抗癌中藥單體。本研究通過網絡藥理學的方法來分析預測紫草素對鼻咽癌的潛在靶點及相關信號通路，再通過實驗驗證其預測結果的有效性，從而為將來的臨床研究提供了依據。

1 材料與方法

1.1 基于網絡藥理學的機制預測

1.1.1 化合物及鼻咽癌靶點的查詢及篩選

通過Pubchem數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索關鍵詞Shikonin得到其3D機構圖，將3D結構圖導入至Pharmmapper數據庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.htmL）中篩得到紫草素相關靶點。通過GeneCards數 據 庫（http://www.genecards.org/）搜索得到鼻咽癌相關靶點。通過venn在線平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制藥物和疾病靶點交集圖。

1.1.2 紫草素與鼻咽癌靶點PPI（protein-protein interaction）的網絡可視化構建及分析

通過String數據庫（https://string-db.org/）將Venn圖取交集得到的基因輸入到String數據庫構建PPI網絡。把得到的PPI網絡輸入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化。通過軟件中的Network Analysis plugin功能對可視化圖中的節點進行統計，并根據Degree值的大小而區分節點的生物功能。

1.1.3 GO功能和KEGG pathway 通路富集

通過David數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對紫草素與鼻咽癌靶點交集進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，用以說明相關靶點在基因功能和信號通路中的作用。GO功能富集分析主要包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組成（cellular component，CC）。通過在線作圖平臺微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）對富集分析結果進行可視化處理。

1.1.4 化合物-靶點-通路網絡圖構建

整合紫草素抗鼻咽癌的交集靶點和KEGG富集分析結果，并導入Cytoscape 3.7.2軟件構建制作“化合物-疾病-靶點-通路”關系網絡圖。

1.2 實驗驗證

1.2.1 CCK-8法驗證紫草素對鼻咽癌細胞增殖的抑制作用

采用CCK-8法評價紫草素對CNE2 細胞增殖抑制作用，取在對數生長期的CNE2 細胞，用0.25%含EDTA的胰酶進行消化處理，重懸為單細胞懸液，以5000/孔接種于96孔培養板中，在37℃、5% CO2的培養箱中貼壁12 h，小心地吸出培養液，分別加入含紫草素的培養基100μL，濃度設為4umol/L，每組設3個復孔。在37℃、5% CO2的培養箱中培養 24、48、72 h 后，吸出含紫草素的培養基，用PBS清洗2遍，按照CCK-8使用說明書，每孔加入 100μL RPMI-1640 培養基和10μL CCK-8，于37℃、5% CO2的培養箱中孵育80 min。用酶標儀檢測在450nm 波長下各孔的光密度（A），計算實驗組紫草素對細胞的抑制率并繪制細胞抑制率曲線。實驗重復3次。

細胞生存率＝(A 紫草素-A 空白)/(A 對照-A空白)

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達

取對數生長期的CNE-2細胞，倒置顯微鏡下觀察計數，調整細胞密度為5×105/mL 接種于6孔板，每孔1.5mL，置于培養箱貼壁培養24h，藥物分組處理細胞結束后，收集細胞，各實驗組細胞用預冷的PBS緩沖液清洗3次，收集細胞后，加入預冷的細胞裂解液裂解細胞，混勻，超聲破碎細胞；細胞液于4℃以12000r/min，離心15min，轉移上清液于新的EP管中并用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。一定量的蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合后煮沸5min，SDSPAGE電泳150V恒壓70min，WB 濕轉(0.45μm的PVDF膜) 270mA恒流65h，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST漂洗3次后分別加入相應一抗4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，室溫二抗反應1h，TBST漂洗3次后進行ECL顯色。用凝膠成像分析系統分析電泳條帶，以內參作對照，計算各處理組目的蛋白的表達情況。

1.2.3 統計學處理

通過SPSS 22.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以表示，兩樣本均數比較使用t檢驗，組間均數比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學機制預測

2.1.1 紫草素潛在靶點預測

通過PubChem 分子庫獲得紫草素3D結構。見圖1。將3D結構導入至Pharmmapper數據庫中篩得到紫草素靶點并通過Uniplot數據庫取得基因名進行進一步校正，按照Norm Fit排序，選取前10個基因名稱和靶點。見表1。

表1 紫草素排名前十的潛在靶點

圖1 紫草素的3D結構

2.1.2 紫草素與鼻咽癌相關的共同靶點

從GeneCards 數據庫獲得與鼻咽癌相關的基因靶點共有 1929個。將1929個鼻咽癌相關基因與184個藥物靶點基因取交集篩選出共同靶點109個，確定其為紫草素抗鼻咽癌的潛在靶點基因。見圖2。

圖2 紫草素抗鼻咽癌的潛在靶點

2.1.3 紫草素與鼻咽癌相關靶點的PPI網絡

從分析蛋白來看，PPI 網絡是了解疾病中多種復雜蛋白質相互交聯功能的基礎。因此，構建了紫草素與鼻咽癌相關靶點的PPI網絡。將109個交集靶點導STRING數據庫，獲得紫草素-鼻咽癌靶點蛋白質互作信息，通過 cytoscage 3.6.1 軟件，獲得蛋白質相互作用(PPI)網絡圖。見圖3。

圖3 紫草素抗鼻咽癌PPI網絡圖

圖4 紫草素抗鼻咽癌GO功能富集分析

該網絡布局是根據節點的度值從小到大梯度按逆時針排序，黃色節點代表紫草素在鼻咽癌中的潛在靶點，內部節點之間的線顯示不同蛋白質之間相互作用關系，度值最高的前70個節點。其中該網絡中度值最高的靶點為MAPK1，度值為63，其次為SRC、AKT1、MAPK14、ESR1、HSP90AA1、MAPK8、CASP3、IGF1、JAK2等，這些度值較高的靶蛋白可能是紫草素抗鼻咽癌的關鍵靶點。

2.1.4 GO 功能富集注釋

將疾病和藥物交集的 51 個共同靶點通過DAVID數據庫進行GO功能富集分析，根據P≤0.01，共篩選出478個GO條目。包括 40條細胞組成(cellular component,CC)、74條分子功能(molecular function,MF）和364條生物過(biological process,BP)。結果表明，涉及蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、激酶活性、AP結合蛋白、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、同蛋白結合蛋白、絲氨酸型內肽酶活性、蛋白質結合蛋白、內肽酶、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等分子功能；涉及多項生物調控機制，包括凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化、蛋白質自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、缺氧反應、蛋白質水解、細胞遷移的正調控、MAPK級聯、信號轉導等生物過程；涉及細胞核、細胞質、核質等細胞組成。推測紫草素治療鼻咽癌可能與蛋白激酶活性、激酶活性、細胞因子活性、AP結合蛋白等物質活性有關，涉及凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化等生物過程。

2.1.5 KEGG通路富集分析

通過DAVID數據庫進行KEGG通路富集分析，共富集得到89條通路。根據P值排序，篩選出與鼻咽癌相關度最高的前16條通路。富集結果顯示在癌癥信號通路(Pathways in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、Ras信號通路(Ras signaling pathway)、Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)等通路上富集較多。見圖5。

圖5 紫草素抗鼻咽癌KEGG富集結果

2.1.6 構建紫草素抗鼻咽癌的“藥物-靶點-疾病-通路”網絡模型

構建“藥物-靶點-疾病-通路”網絡模型，可直觀的展示紫草素與鼻咽癌靶點及通路之間的相互作用以及關鍵途徑。見圖6。圖中左側40個黃色節點代表紫草素抗鼻咽癌交集的靶點，根據節點的degree值按逆時針從小到大梯度排列，右側16個綠色節點則對應了KEGG富集結果中的16條通路，節點之間的連線顯示不同靶點與通路之間相互作用關系，涉及的關鍵基因包括：MAPK1、AKT1、PIK3CG、MAPK8、EGFR、IGF1R、IGF1、MAPK14等。

圖6 “藥物－靶點－疾?。贰本W絡圖

2.2 實驗驗證

2.2.1 CCK8細胞毒性實驗

結果如圖7所示，與對照組比較，CNE2細胞增殖抑制率隨著紫草素濃度的升高及作用時間的延長明顯升高，作用24、48、72h的半抑制濃度（IC50）分別為5.48、4.76、2.36μmol/L。

圖7 紫草素對鼻咽癌CNE2增殖的影響

2.2.2 Western blot實驗檢測紫草素對p-ERK和ERK蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示，4μmol/L濃度的紫草素實驗組ERK和p-ERK表達量顯著低于空白對照組（P<0.01）。見圖8。

圖8 紫草素對CNE-2細胞MAPK/ERK信號通路通路蛋白的影響

3 討論

中藥單體在腫瘤治療中所突出的顯著療效，使得近些年來在中藥單體對相關腫瘤防止的研究上成為熱門焦點[6]，是未來的研究方向和新的探索領域。新近的相關研究表示，紫草素對多種癌癥腫瘤均有顯著的抑制作用[7-9]，其在抑制鼻咽癌細胞增殖也有了一些研究成果，如邢亮等[10]使用紫草素作用于人胚鼻咽上皮HNE2細胞和鼻咽癌CNE2細胞后，實驗結果顯示紫草素可明顯抑制HNE2細胞和鼻咽癌CNE2細胞株的增殖。

本研究基于網絡藥理學進行深入研究，先通過預測紫草素抗鼻咽癌作用靶點，分析其潛在的信號通路和生物過程，構建“藥物-靶點-疾病-通路”模型，推測出紫草素抗鼻咽癌的作用機制，最后對預測結果進行相關實驗驗證。紫草素“藥物-靶點-疾病-通路”網絡顯示MAPK1、AKT1、PIK3CG、MAPK8等度值相對較高，是紫草素治療鼻咽癌的潛在靶點，結合KEGG通路富集分析顯示MAPK/ERK信號通路是紫草素作用于鼻咽癌的關鍵通路。MAPK信號轉導通路在多數人體細胞中都存在，通過把細胞外化學信號傳遞至細胞，引起細胞內部一系列生物學反應，如細胞增殖、轉化、凋亡等過程，具有十分關鍵的作用。MAPK/ERK信號通路參與細胞分化、增殖、凋亡和血管生成等調節，在肝癌、結直腸和子宮內膜癌[11-14]等多種癌癥發揮關鍵作用，是鼻咽癌發生發展的重要調節通路之一。在MAPK/ERK信號通路中，ERK蛋白是極其重要的通路蛋白之一，ERK蛋白是絲/蘇氨酸激酶，可以通過磷酸化絲/蘇氨酸發揮生物學作用。ERK蛋白在絲裂原刺激作用下接受上游分子的級聯信號，然后通過轉位進入胞核。此外，ERK蛋白除了可以磷酸化胞質蛋白外，還可以磷酸化部分核內的轉錄因子如c-myc、ATF2、c-fos、c-Jun、Elk-1分子等，從而調控細胞的增殖、凋亡、分化等生物學活動。因而ERK1和ERK2蛋白在MAPK/ERK信號通路處于信息傳遞的關鍵環節，其表達水平的下調，可直接影響細胞的增殖和凋亡。鄭懿等人[15]的研究表示可通過下調 CCND1 基因的表達來抑制 ERK/MAPK 信號通路從而增進細胞的凋亡，對宮頸癌化療敏感性的提高有明顯作用；楊瑋蔚[16]等的研究也表示RACK1可通過激活ERK1/2信號通路，抑制食管鱗癌Eca109細胞株的增殖，促進其凋亡，對食管癌的發生發展有更進一步的價值。因此本研究通過Western blot實驗驗證這條可能性最大的通路，顯示出了紫草素對ERK1和ERK2蛋白表達具有制作用，證實通過網絡藥理學的預測，紫草素對鼻咽癌通過MAPK/ERK信號通路發揮作用。

本研究通過網絡藥理學靶點通路預測結合細胞實驗、分子實驗等對紫草素治療鼻咽癌進行了系統性的比較分析，通過實驗發現了紫草素對鼻咽癌的抑制作用并驗證了其作用機制，為之后鼻咽癌的臨床治療及實驗研究提供了依據和方向。