結(jié)核性膿胸86例患者術(shù)中留取胸膜組織行耐藥基因檢查PCR的臨床研究

吳進(jìn)超，邵金鳳，侯野，徐微，李秋，高欣悅

（1.吉林省結(jié)核病醫(yī)院 胸外科，吉林 長(zhǎng)春 130500；2.吉林省結(jié)核病醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130500；3.長(zhǎng)春市傳染病醫(yī)院胸外科，吉林 長(zhǎng)春 130500）

0 引言

結(jié)核病作為一種嚴(yán)重的傳染病，對(duì)人們的生命安全產(chǎn)生了巨大的威脅[1]。而隨著抗結(jié)核藥物的廣泛應(yīng)用，許多結(jié)核病患者出現(xiàn)了耐藥性，這就對(duì)疾病的預(yù)防與治療帶來(lái)了不利的影響，結(jié)核病耐藥的出現(xiàn)，使得患者的治療成本升高，耐藥結(jié)核病患者治療周期長(zhǎng)，若不能最短時(shí)間了解耐藥情況，則會(huì)對(duì)治療效果產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。隨著結(jié)核病發(fā)病率增加和耐藥結(jié)核增多，外科手術(shù)治療肺結(jié)核的重要性再次顯現(xiàn)[2]。全球耐藥肺結(jié)核治愈率在50%左右，外科干預(yù)后其治愈率可明顯提高[3-5]。這就需要進(jìn)行快速藥敏試驗(yàn)準(zhǔn)確的診斷，為疾病治療提供可靠保障。因此，本研究在選取86例膿胸患者組織標(biāo)本作為樣本的基礎(chǔ)上，對(duì)熒光PCR探針熔解曲線技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)五種抗結(jié)核藥物的耐藥性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月-2020年12月吉林省結(jié)核病醫(yī)院收治的118例結(jié)核性膿胸患者中進(jìn)行抽樣，均進(jìn)行了結(jié)核分枝桿菌耐藥基因PCR檢測(cè)，將結(jié)核桿菌耐藥基因檢測(cè)PCR陰性者排除，檢測(cè)陽(yáng)性為86例，同時(shí)證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌的86例陽(yáng)性標(biāo)本為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)病原學(xué)或病理學(xué)證實(shí)，或符合結(jié)核性膿胸診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者中男63例，女23例；平均發(fā)病年齡37.52歲。所有患者均行胸膜剝脫術(shù)術(shù)中留取胸膜組織經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌的86例陽(yáng)性標(biāo)本為研究對(duì)象，對(duì)結(jié)核性膿胸患者，術(shù)中行胸膜組織耐藥基因檢測(cè)及結(jié)核菌培養(yǎng)，近期指導(dǎo)結(jié)核用藥，遠(yuǎn)期對(duì)比耐藥基因檢測(cè)及PCR的準(zhǔn)確性，以達(dá)到快速做出是否為結(jié)核及耐藥的診斷，并指導(dǎo)臨床用藥，達(dá)到精準(zhǔn)診斷及精準(zhǔn)治療。

1.2 儀器與試劑

在此次研究中選取的臨床分離株，在進(jìn)行硝基苯甲酸生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定之后，均為結(jié)核分枝桿菌。在研究當(dāng)中，使用的試劑與儀器為RFP、EMB、INH、Sm、左氧氟沙星以及PNB含藥培養(yǎng)基，同時(shí)選用4%的NaOH溶液以及各種耐藥突變檢測(cè)試劑盒。選用的儀器為SLAN-96s型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀以及BY-R18型低溫高速離心機(jī)；分離培養(yǎng)專用酸性羅氏培養(yǎng)基由吉林省結(jié)核病醫(yī)院檢驗(yàn)科結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)室自制。

1.3 組織類標(biāo)本預(yù)處理方式

取少量典型新鮮組織10mg，加入200μL的緩沖液ATL、20μL蛋白酶K，于56℃消化處理至組織消化完全。離心后取上清，加入300μL F5或TB DNA提取液，振蕩混勻重懸，99℃滅活10min，待用。儀器提取：打開(kāi)Lab-Aid 824核酸提取儀電源，儀器啟動(dòng)完成后，儀器控制屏出現(xiàn)初始界面。將試劑條在桌面上輕輕磕碰，使各試劑落入管底，然后從核酸提取儀中取出試管條架，將試劑條放在試管條架上，撕去封管膜。標(biāo)注號(hào)標(biāo)本對(duì)應(yīng)編號(hào)。在各試劑條的左邊第一孔（大孔）中分別加入60μL DTT溶液（1mol/L）、20μL增強(qiáng)液及180μL Buffer N。將取處理好的痰液，灌洗液、沖洗液樣本1.5mL加入試劑條左邊第一孔（大孔）中。將試管條架放入儀器中，試管條架要推到位。將攪拌條插入攪拌架上，要插到位，并用卡扣卡住。選擇實(shí)驗(yàn)“程序運(yùn)行”—“選擇程序”—“MTB-Maxi-1”，然后“返回”2次，點(diǎn)開(kāi)始運(yùn)行程序。運(yùn)行過(guò)程大約45min。儀器程序運(yùn)行完成后，儀器會(huì)鳴笛提示。取出試管條架，各試劑條的最后一孔為純化的DNA，分別吸出，放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的離心管中，備用。最后洗脫液中可能會(huì)有少量磁珠殘留，若需去除殘留的磁珠，可用磁力架手工分離，或?qū)NA溶液于12000rpm離心1min，收集上清即可。石蠟標(biāo)本：取3～5片石蠟切片，脫蠟后根據(jù)新鮮組織處理方法處理。取出PCR反應(yīng)管，在管壁上做好標(biāo)記，離心半徑5cm，5000r/min，離心，擴(kuò)增。之后進(jìn)行雜交，洗膜，顯示結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)與藥敏試驗(yàn)對(duì)研究對(duì)象耐藥結(jié)果的比較，采用McNemar檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)PCR檢測(cè)與藥敏檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行Kappa≥0.75為兩者一致性較好，0.4～0.75為一般；Kappa<0.4為一致性差。

2 結(jié)果

PCR-反向點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果：118例患者中，86例結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，陽(yáng)性率為72.88%。其中86例中55（63.95%）例未檢出H、R、S、E、喹諾酮類耐藥基因突變；31例（36.05%）檢出H、R、S、E、喹諾酮類基因突變。PCR利福平敏感79例，耐藥7例，耐藥率為8.14%（7/86），未檢出0例；異煙肼敏感68例，耐藥18例，耐藥率為20.93%（18/86），未檢出0例；鹽酸乙胺丁醇敏感73例，耐藥10例，耐藥率為11.63%（10/86），未檢出3例；氟喹諾酮類敏感69例，耐藥11例，耐藥率為12.79%（11/86），未檢出6例；鏈霉素敏感54例，耐藥20例，耐藥率為23.26%（20/86），未檢出12例。詳見(jiàn)表1。

表1 PCR-反向點(diǎn)雜交法與藥敏試驗(yàn)對(duì)86例結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性患者耐藥檢測(cè)的比較（n,%）

3 討論

臨床上用于結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)的主要方法是培養(yǎng)法及藥敏試驗(yàn)，被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”[6-9]。但此方法操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，一般需要4～8周，診斷周期長(zhǎng)，且培養(yǎng)困難，敏感度低，不能及時(shí)指導(dǎo)用藥[10]。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)核分枝桿菌的耐藥突變基因檢測(cè)得到了很快發(fā)展[11]。PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)是將PCR-技術(shù)的高敏感度，反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)的高特異性和膜芯片技術(shù)的高通量3種成熟技術(shù)的優(yōu)勢(shì)有效結(jié)合的快速基因診斷手段，可同時(shí)檢測(cè)4種一線藥物的5個(gè)常見(jiàn)耐藥相關(guān)基因上13個(gè)位點(diǎn)的突變[12-14]。并且，其與培養(yǎng)法及藥敏試驗(yàn)相比，簡(jiǎn)便快速，8h即可得出結(jié)果。結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究選取了118例膿胸患者，86例結(jié)核分枝桿菌基因檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為72.88%；其中，31例發(fā)生耐藥基因突變，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本相符[15]。熒光PCR探針熔解曲線是目前臨床應(yīng)用較為廣泛的一種分子檢測(cè)技術(shù)，具有較高的可靠性，相關(guān)文獻(xiàn)表明其敏感度達(dá)85.5%～100%，特異度達(dá)100%，但所示文獻(xiàn)均以PCR-直接測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)。我們發(fā)現(xiàn)其感染結(jié)核菌臨床分離菌株對(duì)R、H、E、S及喹諾酮類的耐藥基因突變，并分析在MTB耐藥基因檢測(cè)中使用熒光PCR熔解曲線法的應(yīng)用價(jià)值。