地黃飲超聲提取工藝的研究*

扈本荃，徐 玥，吳 曼，王 娜

（西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021）

地黃飲出自宋代劉河間的《素問·宣明論方》，主要由熟地、巴戟天、山茱萸、肉蓯蓉等10 余味藥材組方，此方在臨床主要以湯劑口服，用來治療腦中風后遺癥和阿爾茨海默癥，改善、提高患者的認識功能、學習能力和記憶力[1,2]。

地黃飲湯劑傳統(tǒng)工藝為煎煮法,以水為提取劑，應(yīng)用于臨床時，吸收快、起效快。但因分次煎煮合并提取液使用，未濃縮，使用劑量大。

苯乙醇苷類（Phenylethanoid glycoside)天然提取成分松果菊苷(Echinacoside)是君藥肉蓯蓉的有效成分，研究表明，其具有改善學習記憶、保護神經(jīng)等方面作用，但是，在超過60℃時會被破壞[3]。傳統(tǒng)煎煮工藝會破壞地黃飲中的Echinacoside，若能尋找一種既能保護松果菊苷又能保證提取效率的新的提取方法，將會提高地黃飲在臨床上的治療效果，對老年患者的學習記憶能力和認識功能將有明顯的改善和提高。

本文采用正交實驗設(shè)計，考察乙醇濃度、物料溶液比、提取時間和提取溫度對地黃飲超聲提取的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

KQ5200DE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；DINOEX P680A 型高效液相色譜儀（變色龍色譜工作站，戴安公司）；SHHW21.420 型電熱恒溫水浴箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；GR-202 型分析天平（日本A＆D 公司）；101-0 型電熱鼓風恒溫干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；GG17 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）。

馬錢苷對照品（Loganin，含量99.2%，中國藥品生物制品檢定研究院）；Echinacoside對照品（含量92.5%，中國藥品生物制品檢定研究院）；毛蕊花糖苷對照品（Verbascoside，含量94.4%，中國藥品生物制品檢定研究院）；甲醇（色譜純 科密歐試劑有限公司）；其余試劑為分析純；水為純化水。

地黃飲配方藥材從達仁堂藥店購買，均符合中國藥典標準。

1.2 正交因素和水平的選擇

1.2.1 乙醇濃度 根據(jù)文獻[4]報道，在一定條件下，以乙醇為提取劑時，苷類的提取量隨著其中含水量的增加而增加，含水多的乙醇中苷類提取量較大。但乙醇濃度低于50% 時，乙醇提取溶劑中含水量的增加并不增加苷類提取量，但卻使提取液粘度增加、色素干擾增大，增加了提取液應(yīng)用前的后處理的繁瑣度。綜上所述，選擇90%、70%、50%乙醇作為正交試驗考察的因素和水平。

1.2.2 物料溶液比 物料溶液比不同，提取效果不同。物料溶液比太小，降低超聲提取的效果；物料溶液比太大，造成溶劑浪費，而且后期提取液的濃縮處理難度增加。經(jīng)綜合分析，選定物料溶液比1∶8、1∶10、1∶12 作為正交實驗因素水平。

1.2.3 提取時間 超聲提取具有時間短、效率高的特點。超聲波能夠通過空化效應(yīng)、機械效應(yīng)、熱效應(yīng)等[5]使中藥材的細胞壁、細胞膜破碎，溶劑滲透到藥材的胞內(nèi)速度增加，或加速胞內(nèi)的化學成分擴散到胞外，從而提高提取效率。結(jié)合實驗具體情況，以提取時間為20、40、60min 作為正交試驗的考察因素和水平。

1.2.4 提取溫度 據(jù)文獻[6]報道，提取的溫度是影響提取的關(guān)鍵因素之一。溫度過低，會影響有效成分在提取溶劑中的溶出；溫度過高，有些熱敏成分會被破壞，且溶劑揮發(fā)嚴重。綜合考慮，選定25、40、55℃作為正交試驗考察的因素和水平。

1.3 正交實驗

1.3.1 正交實驗因素水平表設(shè)計 以提取地黃飲的乙醇濃度（A），物料溶液比（B），提取時間（C），超聲溫度（D）為因素，每個因素3 個水平，選用L9（34）正交表設(shè)計正交試驗，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Levels of the factors in orthogonal tests

1.3.2 樣品處理 精密稱取1/10 量的地黃飲子配方藥材粉末，按正交設(shè)計（表1）的乙醇濃度及物料溶液比加入提取溶劑，即乙醇，再按正交設(shè)計的提取時間和溫度進行超聲提取，去渣，提取液經(jīng)真空抽濾，濾液于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無蒸發(fā)液留出，真空干燥箱干燥、稱重，計算干固物得率，再將其溶解于80%甲醇中檢測馬錢苷、松果菊苷及毛蕊花糖苷含量。按同樣的過程重復兩次，驗證最佳方案。

1.3.3 考察指標的確定 本方以乙醇為溶劑，君藥熟地黃和巴戟的有效成分在乙醇中的溶解性不如君藥山茱萸和肉蓯蓉的有效成分，山萸肉滋補腎陰，肉蓯蓉溫補腎陽，一陰一陽，故以其為代表，采用山茱萸中的馬錢苷、肉蓯蓉中的松果菊苷和毛蕊花糖苷為考察指標，同時結(jié)合干固物質(zhì)量綜合優(yōu)選最佳工藝。

1.3.4 馬錢苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的測定[7]

色譜條件 色譜柱為Kromasill C18柱（150mm×4.6mm，5μm)；流動相:甲醇-0.01% H3PO4溶液，0～50min 梯度洗脫；流速:1mL·min-1；柱溫：室溫；進樣量：20μL。在240 和334nm 處雙波長檢測。

樣品含量的測定 分別取正交試驗制得的干固物，用適量80%甲醇溶解得供試品儲備液。精密量取上述供試品儲備液用80%甲醇稀釋，依法制得供試品溶液，進樣測定，計算含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗結(jié)果與分析

將地黃飲干固物重量及松果菊苷、毛蕊花糖苷和馬錢苷的含量填入正交表，按照正交試驗的要求進行處理，所得實驗結(jié)果見表2。

經(jīng)直觀分析，地黃飲的最佳提取工藝是A1B3C3D3，即50%乙醇，物料溶液比為1∶12，提取時間60min，提取溫度55℃。由正交實驗結(jié)果中的R 值可以得出，乙醇濃度對提取效果有較顯著的影響，物料溶液比、提取時間和提取溫度等因素的影響均不顯著。影響地黃飲提取率因素的順序依次為：乙醇濃度、提取溫度、物料溶液比、提取時間，該工藝各參數(shù)影響因素最大的是乙醇濃度，最小的是超聲提取時間見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Tab.2 Results of the orthogonal tests

分析其原因，地黃飲在中等濃度的乙醇中溶解度較大，且其中的有效成分含量也較大。傳統(tǒng)提取方法通過升高溫度增加被提取成分的溶解度，同時提高其傳質(zhì)速度，而超聲提取主要通過細胞破碎作用促進被提取成分向液相傳遞，而非常規(guī)的傳質(zhì)作用，因此，溫度的影響在超聲提取中不顯著，適當增加溫度有利于提高成分在溶劑中的溶解度，但超過60℃可增加溶劑揮發(fā)而使溶劑濃度減小，且溫度過高還會破壞有效成分[8-10]。在參考文獻[6]中提到，肉蓯蓉在40～60℃范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，松果菊苷的含量也隨之增加，但溫度超過60℃之后，溫度升高，提取液中松果菊苷含量降低。因此，在提取過程中，要嚴格注意溫度的變化，避免有效成分被破壞。實驗結(jié)果表明，提取時間的影響無顯著性差異，再次證明了因超聲提取效率高，短時間內(nèi)即可實現(xiàn)較完全的提取。物料溶液比對提取效果的影響差異不明顯，證明了超聲提取的耗能少，后續(xù)處理方便。

2.2 工藝驗證實驗

按照篩選的最佳工進行了3 批驗證實驗。以最佳工藝參數(shù)進行提取，正交試驗所得結(jié)論符合實際提取結(jié)果。地黃飲中各主要成分的含量均較高（見表3）。

表3 工藝驗證試驗（%）Tab.3 Results of the verification tests（%）

3 結(jié)論

本實驗以乙醇為提取劑，通過正交試驗對地黃飲的超聲提取工藝進行了優(yōu)選。在確定了超聲提取因素的條件下，以地黃飲干固物及馬錢苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量為指標，得到其最佳超聲提取工藝，即50%乙醇為提取劑，物料溶液比為1∶12，提取時間為60min，提取溫度為55℃。

地黃飲傳統(tǒng)的煎煮提取方法存在耗時、耗能、提取率低等問題。目前，關(guān)于地黃飲的藥理實驗研究較多，而對其提取工藝的研究較少，本實驗的研究結(jié)果可為今后地黃飲的提取方法和工藝的改進提供理論參考。通過正交實驗，減少了提取時間，提高了提取效率，該工藝可重復，方便，便于實驗室及工業(yè)生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用。