黃芪多糖的分離純化及結構鑒定研究進展*

張明宇，馬 悅，王知斌

（黑龍江中醫藥大學 藥學院 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室 黑龍江省中藥天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

藥用黃芪始載于《神農本草經》，為豆科植物蒙 古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.Mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根。于春、秋二季采挖，除去須根和根頭，曬干而得。有排膿止汗、補氣升陽，益衛固表，托毒生肌，利水退腫之功效。黃芪是一年生或多年生草本、亞灌木或灌木，豆科最大的開花植物屬之一，廣泛分布于溫帶和干旱地區[1]。黃芪是中國傳統中藥，藥用歷史已經有2000 多年。本文主要對黃芪多糖Astragalus Polysacharin（APS）類化合物的分離純化及結構鑒定兩個方面的內容進行了綜合歸納，對APS 化合物的性質進行更充分的了解，為其臨床應用提供基礎依據。

1 黃芪多糖的分離純化

1.1 黃芪多糖的提取

APS 提取的常用溶劑包括水、甲醇、乙醇等。方法主要為溶劑提取法，包括水提取法（水煎煮法、堿水提取法）；醇提取法（醇水提取法、堿醇提取法）。其他方法包括微波提取法、超聲波提取法、超高壓提取法、超細粉碎提取法、纖維素酶法。各提取方法操作見表1。

表1 APS 的提取方法Tab.1 Extract method of APS

1.2 分離純化

經過初步的提取得到的是含有雜質的粗APS提取液，欲得到純凈的APS，需要去除蛋白質、色素等多余雜質。

1.2.1 除蛋白質方法 去除蛋白質的方法主要包括Sevage 法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、鞣酸法和蛋白酶水解法等。前3 種方法的原理是加入有機溶劑使樣品中的蛋白質變性成沉淀離心分離；鞣酸可與蛋白質發生特異性反應使其凝固沉淀；蛋白酶法除蛋白的原理是其使樣品中蛋白質降解，再用透析或沉淀的方法除去蛋白質[2]。其中Sevage 法較為常用，條件為Sevage 試劑中氯仿∶正丁醇＝4∶1，粗多糖溶液（2g·L-1）與Sevage 試劑的體積比為2∶1，攪拌時間為25min 時，Sevage 法去除蛋白質反應較為溫和[3]，采用3～4 次處理可達到較為理想的處理結果。若采用Sevage 法處理多糖蛋白6 次，蛋白質含量下降70.8%，多糖損失率為4.4%[4]。即蛋白質含量雖下降，但多糖損失率也隨之升高。據文獻報道，將酶解法和Sevage 法聯用除蛋白效果較好。研究對比Savage 法、絮凝劑法、三氯乙酸法、蛋白酶－Savage 法4 種方法的蛋白質去除率及多糖損失率，結果表明，蛋白酶－Savage 法兩項指標均優于其它方法[5]。

1.2.2 除色素方法 經初步提取的粗多糖常常含有色素，需要進行脫色處理，色素分為脂溶性和水溶性。常用的脫色方法有氧化法、吸附法、離子交換法和金屬絡合物法等[14]。DEAE-纖維素柱吸附法是目前最常用的脫色素方法，利用0.1mol·L-1的NaCl 溶液洗脫，DEAE-纖維素柱純化可以得到APS 的主要級分[15]；采用D101 大孔吸附樹脂純化100mL 濃度為1.8mg·mL-1的黃芪粗多糖溶液時，采用4 BV 的50%乙醇為洗脫劑，以1mL·min-1的流速進行洗脫為最佳條件，可獲得純度為65.1%的APS[16]；采用AB-8 大孔吸附樹脂純化不同濃度乙醇洗脫樣品，得到的APS 最高純度可達96.1%[17]；通過比較S-8、AB-8、X-5、NKA-9、D4020 和D3520 6 種樹脂吸附APS 的吸附量及解吸率，結果表明，X-5 樹脂固定床進行分離富集后，APS 的回收率較高，并且純度得到了提高[18]。以可見光區光譜曲線下面積為測定指標對比粉末活性炭脫色、顆?；钚蕴棵撋?、DEAE-52脫色、過氧化氫脫色4 種除去APS 色素的方法，發現DEAE-52 脫色素在不損失較多多糖的同時，有著相對較高的色素脫除率[19]。

2 黃芪多糖的結構鑒定

黃芪多糖結構測定方法可分為化學分析法和儀器分析法。

傳統的化學分析方法 主要包括多糖分子量的測定、單糖組成分析、糖醛酸還原、完全酸水解、部分酸水解、甲基化分析、高碘酸氧化和Smith 降解法；

儀器分析法 主要包括旋光度測定法、紫外光譜（UV）、傅里葉紅外光譜（FTIR）、核磁共振（NMR）、氣相色譜（GC）和質譜（MS）等。

（1）鑒定中藥各種化學成分的分子結構 旋光度法只能鑒定有旋光性的化合物，可根據產生的旋光性的不同區分化合物是否存在雜質。紫外光譜（UV）是由于電子的躍遷落于紫外可見光區而產生的，因此，可根據不同類型的化合物的紫外吸收強度判斷化合物類型，當光子不足以使電子躍遷而落于不可見的紅外光區時，就可能引發原子和基團共價鍵合的振動能級躍遷，使共價鍵發生不同類型的振動。因此，通過傅里葉紅外光譜（FTIR）可觀察化合物的結構和化學鍵的信息。核磁共振（NMR）對于中藥化學成分結構的鑒定往往查看其對應的一維譜圖和二維譜圖，兩者相互結合分析得出結構信息，熟練掌握后甚至可以從數據中直接推斷原子的連通性和空間排列[20]。

（2）中藥組分分離與定量分析或定性鑒定 采用氣相色譜（GC）與質譜（MS）聯用于進行分析與鑒定。樣品制備步驟簡單，樣品用量少，避免了提取和蒸餾過程中溶劑中雜質的潛在干擾，尤其適用于中藥中可揮發性成分。

（3）越來越多的研究著重于APS 結構分析的單糖組成和糖苷鍵連接狀況。對膜莢黃芪內的低分子量多糖LMW-ASP 進行結構解析，經過高碘酸鹽氧化和Smith 降解處理后通過GC 系統得出其分子量為5.6×103Da，由Glc、Gal、Ara、Xyl、GalA 組成，其摩爾比為10.0∶1.3∶1.7∶1.0∶0.9[21]；蒙古黃芪內的多糖經FTIR 和GC 系統結構解析后發現，其單糖由Ara、Man、Glu、Gal 組成，摩爾比為0.0992∶1.26∶1.00∶0.0115[22]；通過UV、FTIR、HPLC 等方法對膜莢黃芪內APS 進行結構解析發現其分子量為1.77×106、1.59×104Da 的APS 占比分別為38%和57%，單糖由Glc、Gal、Ara 組成，摩爾比為27.92∶5.20∶2.86[23]；從蒙古黃芪中提取的一種黃芪多糖降解物純化后經單糖組成分析、高碘酸鹽氧化和Smith 降解、甲基化分析、ESI-MS、FTIR 和NMR 等方法技術發現由Rha以（3→）連接，Rha 以（1→3）連接，Araf 以（1→3,4）連接，Gal 以（1→3）連接，末端殘基以-Gal 和-Glc 連接組成[24]。

各種APS 結構鑒定見表2。

表2 APS 的結構鑒定Tab.2 Structure identification of APS

3 結語

黃芪在中藥使用上有“十藥九芪”之稱，被譽為“補氣圣藥”，因此，受到國內外學者的廣泛關注，黃芪是一味藥用歷史悠久、醫學應用極廣的傳統中藥材，具有價格低廉、資源豐富、毒副作用小的優點，隨著對其作用效果的深入研究而被應用于實際生產當中。例如將黃芪多糖用于家禽生產、疫苗研究、作為免疫興奮劑、滋補劑、抗氧化劑、保肝劑、利尿劑、抗糖尿病、抗癌和祛痰劑等，充分利用其藥理作用制成合適的劑型來治療各種疾病，例如注射液被用來治療心臟疾病、血液腫瘤疾病及泌尿系統疾病等，可見其廣闊的發展前景。

APS 分離純化和結構鑒定是生物活性方向研究的基礎。在APS 的分離純化中，考慮到實際分離純化目的和經濟條件，往往需要一種或幾種分離純化的方法相結合的方式進行。藥材種類、提取溶劑、粉碎粒徑、提取時間以及除雜方法均會影響提取效率，目前仍沒有能夠獲得量大且純凈的APS 的方法。在APS 結構鑒定方面，不同的分離純化技術會直接影響多糖的結構，采用不同的提取、分離方法得到的多糖，單糖組成、糖苷鍵連接狀況、分子量大小可能均有所不同。多糖的結構復雜，能夠明確多糖上述信息的方法已經較為成熟，但是明確其構效關系仍然是目前研究的難題。未來的分離純化和結構鑒定應著重于APS 這兩個方向研究，為黃芪多糖的深入臨床藥用奠定基礎。