蕎麥殼中總黃酮含量測定方法優(yōu)選*

蘇學(xué)軍，裘 可，宗春燕

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

蕎麥?zhǔn)且环N一年生雙子葉植物，可藥食兩用。作為消費者喜愛的一種小宗雜糧，蕎麥具有獨特的營養(yǎng)優(yōu)勢，不僅營養(yǎng)素全面、礦物元素含量豐富，還含有其它禾谷類糧食較為缺乏的賴氨酸和黃酮類物質(zhì)[1]，常被人們視為“養(yǎng)顏益壽食物、天然保健珍品”。蕎麥殼是制作蕎麥仁時產(chǎn)生的副產(chǎn)品，目前，蕎麥殼除部分用于制作枕芯或飼料外，其余大多作為廢棄物而被拋棄[2]。近年來的研究表明，蕎麥殼中含有多種活性組分，尤其以黃酮類活性物質(zhì)居多[2]。蕎麥黃酮抗氧化能力強(qiáng)[3]，長期食用可以降血糖、降血脂，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，甚至有一定防癌抗癌功效[4-6]。從蕎麥殼中提取出的黃酮類物質(zhì)，特別是蘆丁，臨床上可用于消炎、利尿、解痙、治療血管病、肥胖癥等癥狀[7]，而使其深受人們的關(guān)注。

目前，對于蕎麥殼中黃酮含量的測定方法主要采用高效液相色譜法（HPLC）和分光光度法（UV）[8]。HPLC 法雖能同時測定樣品中的多種黃酮類組分，但獲得的是各黃酮單體的含量，在無法得知樣品中所有黃酮類組分的情況下，難以完成總黃酮含量的測定。由于蕎麥殼中的黃酮類物質(zhì)種類較多[9]，因而測定總黃酮含量時選擇分光光度法為宜。本文以蘆丁為對照品，考察了直接測定法、AlCl3-NaAc 比色法及NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法對蕎麥殼總黃酮含量測定的可行性，篩選出一種適宜的測定方法，以期為蕎麥殼中總黃酮的提取開發(fā)利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

蕎麥殼（新街糧油加工廠提供（系泰興甜蕎））；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；無水乙醇、NaNO2、AlCl3、Al（NO3）3、NaOH、NaAc，均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1801 型紫外-可見分光光度計（北京北分瑞利儀器有限責(zé)任公司）；KQ5200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；BJ-150 型多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）；80-2 型臺式離心機(jī)（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 蕎麥殼中總黃酮的提取 取適量蕎麥殼置減壓烘箱中低溫烘干水分，直至恒重，取出后立刻粉碎過篩。準(zhǔn)確稱取3g 蕎麥殼粉末，放入250mL 三口燒瓶中，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，設(shè)定料液比為1∶20（g·mL-1），室溫下浸泡1h，然后置于70℃的水浴中回流提取1h。提取液經(jīng)離心分離后，收集至棕色容量瓶中，冷藏備用。

1.3.2 對照品溶液的配制 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品19.8mg，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，室溫下置超聲波清洗器中超聲一段時間，待全部溶解后，轉(zhuǎn)入100mL 的棕色容量瓶中，再以上述乙醇定容至刻度，搖勻，配成濃度為198μg·mL-1的蘆丁對照品溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 蕎麥殼中的總黃酮含量測定方法

直接測定法 取2 只25mL 的潔凈的容量瓶，分別移入1mL 蕎麥殼提取液、1mL 蘆丁對照品溶液，再分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液定容，搖勻后，靜置15min，以試劑為空白，在200～600nm 區(qū)間進(jìn)行光譜掃描。

AlCl3-NaAc 比色法 取2 只25mL 的潔凈的容量瓶，分別移入1mL 蕎麥殼提取液、1mL 蘆丁對照品溶液，再分別加入1.5%的AlCl3溶液4mL，1mol·L-1NaAc 溶液8mL，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液定容，搖勻后置于30℃水浴中顯色反應(yīng)15min，以試劑為空白，在300～600nm 區(qū)間進(jìn)行光譜掃描。

NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法 取2 只25mL的潔凈的容量瓶，分別移入1mL 蕎麥殼提取液、1mL蘆丁對照品溶液，然后再分別依次移入5%的NaNO2試劑1mL，搖勻靜置6min，移入10%的Al（NO3）3試劑1mL，再搖勻靜置6min，最后加入10mL 4%的NaOH 溶液，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液定容，搖勻后，靜置15min，以試劑為空白，在400～600nm 區(qū)間進(jìn)行光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 蕎麥殼中總黃酮測定方法優(yōu)選

蘆丁及蕎麥殼樣品的吸收光譜曲線見圖1。

圖1 直接測定法吸收光譜曲線Fig.1 Absorption spectrum curve of direct determination method

由圖1 可知，兩種物質(zhì)在紫外區(qū)的吸收帶各不相同，蘆丁在紫外區(qū)存在兩個吸收峰，分別位于257.5 和362nm 處，而蕎麥殼樣品僅有一個吸收峰在275nm 處。由于紫外區(qū)的測定易受溶劑及雜質(zhì)的干擾[10]，且樣品與蘆丁的吸收峰相距較遠(yuǎn)，故不宜選用直接測定法測定。

圖2 為AlCl3-NaAc 比色法的吸收光譜曲線。

圖2 AlCl3-NaAc 比色法吸收光譜曲線Fig.2 Absorption spectrum curve of AlCl3-NaAc colorimetric method

在蘆丁對照品溶液中加入AlCl3顯色劑后，蘆丁的最大吸收峰紅移至416nm 處，而蕎麥殼提取液的最大吸收波長在可見光區(qū)為404nm。故該法以蘆丁為對照品時，可選擇416nm 作為測定波長。由于提取液在416nm 處存在本底吸收，因此，后續(xù)測定樣品中總黃酮含量時，以試液空白為參比，測定吸光度值。

圖3 是NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法的吸收光譜曲線。

圖3 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法吸收光譜曲線Fig.3 Absorption spectrum curve of NaNO2-Al（NO3）3-NaOH colorimetric method

該法待顯色反應(yīng)發(fā)生后，溶液中會出現(xiàn)較多絮狀物，離心過濾后測定吸收曲線。蕎麥殼提取液的最大吸收波長位于491nm 處，而蘆丁在505nm 處有一明顯的吸收峰，因此，可選擇505nm 作為測定波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

移取濃度為198μg·mL-1的蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，按1.3.3 中AlCl3-NaAc 比色法與NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在各法最大吸收波長下測定相應(yīng)吸光度。以吸光度A 為縱坐標(biāo)，濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，得到前者線性方程為A=0.0270C+0.0570，R=0.9999；后者線性方程為A=0.0104C-0.0031，R=0.9998。

2.3 蕎麥殼中總黃酮含量測定比較

采用AlCl3-NaAc 比色法和NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法測定蕎麥殼中的總黃酮含量，實驗結(jié)果見表1。

表1 2 種比色法測定蕎麥殼中的總黃酮（mg·g-1）Tab.1 Determination of total flavonoids in buckwheat hull by two colorimetric methods

由表1 可以看出，后法的測定值明顯高于前法。這是由于蕎麥殼提取液中的兒茶素、咖啡酸等酚酸類物質(zhì)在堿性條件下可與Al（NO3）3發(fā)生顯色反應(yīng)，造成測定值偏大。因此，測定蕎麥殼中的總黃酮，采用AlCl3比色法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性 精密移取1mL 蕎麥殼提取液，按1.3.3 中AlCl3-NaAc 比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)后，在靜置10、20、30、40、50、60min 時，于416nm 處測定吸光度值，分別為0.3354、0.3401、0.3397、0.3444、0.3500、0.3456，平均吸光度為0.3425，RSD 為1.20%。表明蕎麥殼提取液采用AlCl3-NaAc 比色法顯色后，吸光度在10～60min 內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2.4.2 精密度 精密移取1mL 蕎麥殼提取液，采用AlCl3-NaAc 比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，于416nm 處連續(xù)測定6 次吸光度值，分別為：0.3389、0.3391、0.3404、0.3395、0.3400、0.3398，計算RSD 為0.12%，說明方法的精密度良好。

2.4.3 重現(xiàn)性 按1.3.1 制備蕎麥殼提取液，平行移取6 份樣品，均為1mL，采用AlCl3-NaAc 比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，每份樣品測定3 次，計算蕎麥殼總黃酮含量分 別 為5.324、5.246、5.339、5.424、5.377、5.274mg·g-1，RSD 為0.92%，表明方法的重現(xiàn)性較好。

2.4.4 加標(biāo)回收率 精密移取1mL 蕎麥殼提取液5份，再分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，采用AlCl3-NaAc 比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)后，測定吸光度并考察方法的回收率，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗Tab.2 Standard addition recovery test

由表2 可知，該法的加標(biāo)回收率在97.47%～103.53%之間，RSD 為1.92%，顯示結(jié)果較為可靠。

3 結(jié)論

本實驗利用紫外可見分光光度法測定蕎麥殼中的總黃酮，通過比較3 種比色法的光譜吸收曲線，并通過方法學(xué)驗證，確定以蘆丁為對照品，采用AlCl3-NaAc 比色法于最大吸收波長416nm 處測定黃酮含量。結(jié)果顯示，該方法操作簡便，穩(wěn)定性好，專一性強(qiáng)，加標(biāo)回收率為97.47%～103.53%，可作為蕎麥殼中總黃酮的定量分析方法。