咳嗽變異性哮喘患兒外周血miR-155、SOCS-1表達(dá)變化與Th1/Th2失衡的關(guān)系

李雯，趙偉偉，葛建敏，吳俊峰，董建芳

張家口市第一醫(yī)院，河北張家口075000

咳嗽變異性哮喘（CVA）是一種以咳嗽為主的不典型哮喘，具有與典型哮喘類似的臨床和病理生理特征，如季節(jié)性咳嗽、氣道高反應(yīng)性、嗜酸性氣道炎癥和氣道重塑等。CVA 是導(dǎo)致兒童慢性咳嗽的主要原因，部分患者可進(jìn)展為典型哮喘［1］。CAV 存在輔助型T 細(xì)胞1（Th1）/輔助型T 細(xì)胞2（Th2）失衡，表現(xiàn)為以Th2 為主的免疫反應(yīng)。Th2 相關(guān)細(xì)胞因子可誘導(dǎo)炎性介質(zhì)釋放，導(dǎo)致局部氣道炎性細(xì)胞浸潤［2］。微小RNA 是一類小編碼RNA，在細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等病理生理過程中發(fā)揮重要作用［3］。微小RNA-155（miR-155）是一種多功能性非編碼蛋白RNA，其表達(dá)與癌癥發(fā)展、炎癥反應(yīng)和免疫穩(wěn)態(tài)有關(guān)，參與Th2 相關(guān)免疫應(yīng)答［4］。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白抑制蛋白1（SOCS-1）是一種通過抑制Janus激酶（JAK）/轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器和激活因子（STAT）來調(diào)控細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)控作用［5］。SOCS-1在活化單核細(xì)胞中異常表達(dá)，誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞分化，參與過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展［6］。因此，本研究擬探討 miR-155、SOCS-1 與CVA 患兒Th1/Th2 失衡的關(guān)系，以期為臨床CVA 治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2018 年 3 月—2020 年 6 月本院收治的103 例CVA 患兒（CVA 組），納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有典型CAV 癥狀，符合2013 版《中國兒童慢性咳嗽診斷與治療指南》中CAV診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②病程大于1 個月；③肺功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、肺部感染等疾病；②過敏性疾病、免疫性疾病、感染性疾病；③近1 個月服用免疫抑制劑；④合并惡性腫瘤。其中男59 例、女44例，年齡 2～12（7.25 ± 2.16）歲，有哮喘家族史 42例，過敏體質(zhì)21 例，IgE 陽性53 例。另選擇同期本院兒科保健門診接診的72例健康兒童為對照組，均經(jīng)門診體檢排除呼吸道感染、哮喘、高血壓、糖尿病、免疫性疾病等。其中男39 例、女33 例，年齡2～11（7.93 ± 2.04）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。受試兒童法定監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 外周血miR-155、SOCS-1 mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR 法。采集兩組空腹靜脈血5 mL，注入EDTA 抗凝管，4 ℃ 3 000 r/min 離心 20 min（離心半徑10 cm），分離血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ覝貜?fù)融血漿樣本，采用TRIzol 試劑（美國Ambio 公司）提取總RNA，采用 CFX96 實(shí)時熒光PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Epicentre 公司）進(jìn)行RT-PCR，將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系共18 μL，包括RNA 模板 5 μL，OligodT 1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μL）1 μL，RNA 酶 抑 制劑（20 U/μL）0.5 μL，dNTPs（100 mmol/L）1 μL，Buffer 液1.5 μL，DEPC 水5 μL，U6及miRNA引物3 μL。引物合成及序列測定由上海基康公司完成。miR-155 上游引物5'-CGTTAATGC?TAATCGTGATAG-3'，下 游 引 物 5'-GCAGGGTCC?GAGGT-3'；SOCS-1 上 游 引 物 5'-AGACCCCTTCT?CACCTCTTG-3'， 下 游 引 物 5'-CTGCACAG?CAGAAAAATAAAGC-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTC?GGCAGCACA-3'，下 游 引 物 5'-AACGCTTCAC?GAATTTGCGT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，65 ℃變性 20 s；75 ℃退火15 s，共40 個循環(huán)。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性 15 s、60 ℃退火 60 s，45 個循環(huán)，共進(jìn)行 3 次平行試驗(yàn)。用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-155、SOCS-1 mRNA相對表達(dá)量。

1.3 外周血Th1、Th2 及其相關(guān)細(xì)胞因子檢測 采集兩組肘靜脈血6 mL，一份注入EDTA 抗凝管混勻檢測Th1、Th2，一份注入干燥試管檢測相關(guān)細(xì)胞因子。取100 μL 血液標(biāo)本注入流式檢測管，加入Per?CP-小鼠抗人CD4 單克隆抗體IgG，室溫避光孵育30 min，加入 2 mL 紅細(xì)胞 lysis Buffer 混勻，室溫避光孵育10 min，300 g 離心5 cm（離心半徑10 cm）棄上清，用2 mL 磷酸鹽緩沖液洗滌。加入PerCP-抗CD3和PE-抗CD8抗體，再次離心洗滌，加入500 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，制成外周血單個核細(xì)胞液懸液（1×104/mL）。用 EPICS-XL 流式細(xì)胞儀檢測 Th1、Th2 細(xì)胞比例，計(jì)算Th1/Th2。干燥試管血標(biāo)本置于安徽中科中佳臺式離心機(jī)KDC-1044L 進(jìn)行離心處理，離心半徑為15 cm，離心速率3 000 r/min，離心時間為10 min，取血清-80 ℃保存。采用酶鏈免疫吸附試驗(yàn)檢測Th1 細(xì)胞分泌的干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（IL-2）及Th2 細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10。試劑盒購自上海透景生命科技股份有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR-155、SOCS-1 mRNA 表達(dá)比較 CVA 組外周血 miR-155、SOCS-1 mRNA 相對表達(dá)量高于對照組（P均<0.05），見表1。

表1 兩組miR-155、SOCS-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表1 兩組miR-155、SOCS-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

組別CVA組對照組t P n 103 72 miR-155 1.32±0.42 0.39±0.05 22.697<0.05 SOCS-1 mRNA 1.21±0.32 0.25±0.06 29.486<0.05

2.2 兩組 Th1、Th2、Th1/Th2 及其相關(guān)細(xì)胞因子比較 CVA 組 Th2 比例及 IL-4、IL-10 水平高于對照組（P均<0.05），Th1 比例、Th1/Th2 及 INF-γ、IL-2 水平低于對照組（P均<0.05），見表2、3。

表2 兩組Th1、Th2及Th1/Th2比較（±s）

表2 兩組Th1、Th2及Th1/Th2比較（±s）

組別CVA組對照組t P n 103 72 Th1（%）3.62±0.72 6.42±2.13 12.453<0.05 Th2（%）3.31±2.09 1.39±0.42 13.697<0.05 Th1/Th2 1.09±0.27 4.76±1.51 23.925<0.05

表3 兩組相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 兩組相關(guān)細(xì)胞因子水平比較（pg/mL，±s）

組別CVA組對照組t P n 103 72 INF-γ 46.35± 9.59 62.35±15.49 8.782<0.05 IL-2 32.15± 6.28 52.35±13.49 13.575<0.05 IL-4 46.35±9.35 20.21±3.56 5.997<0.05 IL-10 26.35±5.15 13.43±4.23 19.386<0.05

2.3 CVA 組外周血 miR-155、SOCS-1 mRNA 表達(dá)與Th1、Th2、Th1/Th2 及相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性 CVA組患者外周血miR-155 表達(dá)與SOCS-1 mRNA 表達(dá)呈 正相 關(guān)（r=0.612，P<0.05）。CVA 組 外 周 血miR-155、SOCS-1 mRNA表達(dá)與Th2比例、IL-4、IL-10呈正相關(guān)（P均<0.05），與Th1比例、Th1/Th2、INF-γ、IL-2均呈負(fù)相關(guān)（P均<0.05）。見表4。

3 討論

CVA 是典型哮喘的前驅(qū)癥狀，患兒臨床僅表現(xiàn)為咳嗽，無喘息或呼吸短促，肺功能正常，但是CVA患兒可出現(xiàn)呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤、平滑肌痙攣、氣道高反應(yīng)性和呼吸道重構(gòu)［7］。CVA 患兒對抗生素治療無反應(yīng)，但傳統(tǒng)哮喘治療有效，被認(rèn)為是特殊表型的哮喘，30%～40%的CVA 可發(fā)展成為典型哮喘，嚴(yán)重影響肺功能［8-9］。哮喘患者存在顯著的Th1/Th2 失衡，Th2 亞群占優(yōu)勢易引起IgE 血癥、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥，在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10-11］。CVA 與典型哮喘發(fā)病機(jī)制大致相同，Th1/Th2失衡引起的Th2優(yōu)勢應(yīng)答可能是其重要的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制［12］。

表4 CVA組外周血miR-155、SOCS-1與Th1、Th2、Th1/Th2及相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性

Th1、Th2 細(xì)胞分化和平衡調(diào)節(jié)通過細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、信號途徑實(shí)現(xiàn)。miRNA 在免疫細(xì)胞發(fā)育分化中起調(diào)控作用，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致免疫紊亂［13］。miR-155來源于B細(xì)胞整合簇，在人胸腺、脾臟、肺等富含免疫細(xì)胞器官中高表達(dá)，在Th 細(xì)胞分化、細(xì)胞因子生成、免疫監(jiān)管中發(fā)揮重要作用［14］。miR-155與免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病密切相關(guān)。現(xiàn)有研究顯示，miR-155 在免疫性血小板減少癥患者中表達(dá)上調(diào)，與 B 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)［15］，miR-155 在過敏性紫癜患者表達(dá)升高，參與調(diào)節(jié)過敏性氣道炎癥反應(yīng)以及IL-33信號傳導(dǎo)［16］。miR-155與哮喘的發(fā)生也有著密切的關(guān)系，在介導(dǎo)T 細(xì)胞過敏性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 在 CVA 患兒中表達(dá)增高，且 miR-155 表達(dá)與 Th2 比例、IL-4、IL-10 呈正相關(guān)，與Th1、Th1/Th2、INF-γ、IL-2 呈負(fù)相關(guān)，說明Th1/Th2 與CVA 患兒Th1/Th2 失衡有關(guān)。相關(guān)報(bào)道指出miR-155參與T細(xì)胞免疫反應(yīng)和相關(guān)細(xì)胞功能，過表達(dá) miR-155 可促進(jìn) IFN-γ 誘導(dǎo)的 Th1 細(xì)胞分化，促進(jìn)IL-4 誘導(dǎo)的 Th2 表型，miR-155 缺失是導(dǎo)致 Th2 活化受損的主要原因［4］。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）可抑制CD4+T 細(xì)胞中miR-155 表達(dá)，細(xì)胞毒 T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原 4（CTLA-4）是 MALAT1 上游調(diào)節(jié)因子，CTLA-4/MALAT1/ miR-155 軸參與Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)［18］。以上結(jié)果提示，miR-155是CVA患兒Th2相關(guān)變態(tài)反應(yīng)性疾病的關(guān)鍵介質(zhì)。

SOCS-1是細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，經(jīng) IL-6 刺激 M1細(xì)胞后誘導(dǎo) STAT3 活化，SOCS-1 通過與JAK 催化域JH1 區(qū)絡(luò)氨酸殘基結(jié)合反饋性調(diào)控 JAK/STAT 信號通路，影響細(xì)胞增殖分化［19］。SOCS-1 還可通過toll 樣受體（TLR）促效劑阻斷TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與多種免疫反應(yīng)調(diào)控［20］。現(xiàn)有報(bào)道顯示SOCS-1 參與兒童過敏性紫癜T 輔助17 細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞失衡調(diào)節(jié)過程［21］，與哮喘發(fā)病也密切相關(guān)［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，SOCS-1 在 CVA 患兒中表達(dá)升高，且其表達(dá)與Th1/Th2失衡有關(guān)，說明SOCS-1參與了Th1/Th2 的調(diào)控過程。機(jī)體在抗原刺激下JAK/STAT信號通路活化，促使SOCS-1表達(dá)，SOCS-1負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控Th1/Th2 處于動態(tài)平衡中，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，SOCS-1 調(diào)控異常可引起Th1/Th2 失衡［23］。SOCS-1 參與 CVA 患兒 Th1/Th2 失衡的機(jī)制可能為：CVA 局部氣道炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)IL-6分泌增加，IL-6 通過 JAK/STAT 途徑誘導(dǎo) SOCS-1 表達(dá)抑制Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ分泌；另一方面通過Ras 蛋白/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶途徑活化T 細(xì)胞核因子2，促使IL-4 介導(dǎo)的Th2 細(xì)胞分化。說明SOCS-1 可干擾IFN-γ 信號途徑抑制Th1 分化，激活I(lǐng)L-4 信號途徑促使Th2 細(xì)胞優(yōu)勢活化，導(dǎo)致Th1/Th2失衡［24］。

本研究中miR-155 與SOCS-1 表達(dá)呈正相關(guān)，說明 miR-155、SOCS-1 在 CVA 患兒 Th1/Th2 失衡中發(fā)揮作用。研究顯示，SOCS-1 是miR-155 的靶點(diǎn)，miR-155可調(diào)控SOCS-1表達(dá)，二者參與小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)［25］。miR-155/SOCS-1軸在登革病毒感染介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［26］。以上結(jié)果提示，miR-155/SOCS-1 軸參與CVA患兒Th1/Th2失衡過程。miR-155、SOCS-1可直接調(diào)控T 淋巴細(xì)胞分化，也可通過miR-155/SOCS-1軸抑制Th1 細(xì)胞分化，促使Th2 優(yōu)勢反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)CVA發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，CVA 患兒外周血miR-155、SOCS-1呈高表達(dá)，miR-155、SOCS-1 可能參與了 CVA 患兒Th1/Th2 失衡過程。由于Th1/Th2 調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，miR-155、SOCS-1 在 CVA 患兒 Th1/Th2 失衡中的調(diào)控機(jī)制尚待更多基礎(chǔ)研究和體外研究證實(shí)。