昆明漢族2 型糖尿病患者GAS6 基因rs8191974位點的多態性、血漿水平變化及意義

董雪娥，李會芳，王玉明，劉偉軍

昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650031

2 型糖尿?。═2DM）是一種遺傳和環境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復雜疾病，其發病的主要因素為胰島素抵抗（IR）和β細胞功能缺陷導致胰島素相對或絕對不足和（或）作用障礙。生長停滯特異性蛋白6（GAS6）屬于維生素K 依賴蛋白家族，是受體酪氨酸激酶家族TAM 受體（包括Tyro3、Axl、Mer）的共同配體。有研究表明，GAS6 可降低葡萄糖刺激的血漿胰島素分泌水平并促進胰島β細胞的增殖［1-2］。GAS6 基因多態性及其血漿水平與T2DM、肥胖及 IR 有相關性［3-4］，GAS6 基因 rs8191974 位點 A等位基因及血漿GAS6 水平升高可能是T2DM 患者的保護因素［5-7］；而對中國北方漢族人群的研究顯示，GAS6基因rs8191974位點T等位基因是T2DM患者的保護性因素［8］?？梢姴煌N族及不同區域的T2DM 患者基因多態性分布可能存在異質性。故本研究以昆明漢族T2DM 患者為研究對象，探討其GAS6 基因rs8191974 位點的多態性及血漿水平變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年2—12 月就診于本院的 T2DM 患者 352 例（T2DM 組），均符合 1999 年WHO 制訂的糖尿病診斷標準［9］，均為昆明戶籍且居住在昆明市，漢族。其中男178 例，女174 例，年齡（52.53 ± 10.92）歲，平均病程6.05 年。排除標準：其他類型糖尿病和（或）有糖尿病急性并發癥；有心腦血管、血液系統、自身免疫性及其他內分泌代謝疾??；近期有感染、手術、創傷等應激因素；嚴重肝腎功能不全。同期選取本院體檢中心昆明地區漢族人群體檢結果正常且無糖尿病史者186 例作為對照組，男101 例，女85 例，年齡（51.90 ± 5.27）歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義（P均>0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，兩組均簽署知情同意書。

1.2 GAS6 基因rs8191974 位點多態性檢測 采用PCR 法與單向基因測序法。DNA 提?。哼x用EDTA抗凝管取兩組外周靜脈血4 mL，按照全血基因組DNA 提取試劑盒（北京博邁德科技發展有限公司）說明書進行操作，將提取的DNA 溶液放置-20 ℃保存備用。PCR 擴增：PCR 反應體系 25 μL，其中DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2× Tap PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，72 ℃終末延伸7 min，共35 個循環，4 ℃保溫1 min。將PCR 擴增產物和GAS6 基因rs8191974 位點的引物（上游序列5'-TTGAGCGCACCTTGCGTGTG-3'、下游序列5'-ACTGTGAGCTGGGAGTTGCC-3'）送上海生物工程有限公司，檢測其基因多態性。

1.3 血漿GAS6 水平檢測 采集兩組清晨空腹外周靜脈血4 mL，置于EDTA 抗凝管中顛倒混勻，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑15 cm，分離血漿，于-20 ℃凍存。采用ELISA 雙抗體夾心法檢測血漿GAS6。ELISA 試劑盒購自無錫東林科技發展有限責任公司。

1.4 HbA1c、FPG 檢測及 IR 指數（HOMA-IR）計算 血液標本采集同1.3，用高效液相色譜法檢測HbA1c、葡萄糖氧化酶法檢測FPG、放射免疫法檢測空腹胰島素（FINS），計算 HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5［10］。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料用中位數±四分位間距［M（Q）］表示，組間比較采用秩和檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；用Spearman 相關法分析血漿GAS6 水平與HbA1c、FPG、HOMA-IR 的相關性。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組基因測序結果 GAS6 基因rs8191974 位點的三種基因型分別為GG、GA、AA。兩組均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P均>0.05）。兩組GAS6基因rs8191974位點基因型頻率比較差異有統計學意義（χ2=11.360，P<0.05）。見表1。

表1 兩組GAS6基因rs8191974位點等位基因型頻率比較（%）

2.2 兩組 HbA1c、FPG、HOMA-IR 及血漿 GAS6 水平比較 兩組三種基因型之間HbA1c、FPG、HOMAIR 比較差異無統計學意義（P均>0.05），而GAS6 水平比較差異有統計學意義（P<0.05）。兩組GG 基因型血漿GAS6 水平比GA、AA 基因型低（P均<0.05）。見表2。

2.3 T2DM 組 血 漿 GAS6 水 平 與 HbA1c、FPG、HOMA-IR 的相關性 剔除年齡、性別因素后，行偏相關分析，T2DM 組血漿 GAS6 水平與 HbA1c、FPG、HOMA-IR無相關性（r分別為-0.217、-0.344、-0.186，P均>0.05）。

表2 兩組HbA1c、FPG、HOMA-IR及血漿GAS6水平［M（Q）］

3 討論

GAS6 基因由678 個氨基酸組成，其氨基酸序列與血漿抗凝蛋白S 有44%的同源性，對細胞生長起負性調節作用［11］。Axl 是受體酪氨酸激酶家族成員之一，與Gas6 結合后激活自身酪氨酸激酶活性，調節細胞的增殖、凋亡、趨化、黏附和識別等多種生理功能［12］。有研究報道，通過基因敲除阻斷GAS6/Axl信號通路會使小鼠的血糖水平升高，脂肪沉積增加，導致小鼠T2DM 發病。GAS6/Axl信號通路的激活有助于促進骨骼肌PI3K/AKT的磷酸化，增加骨骼肌中Glut4向細胞膜的轉位，促進小鼠體內血糖吸收［13］。

GAS6 與炎癥、肥胖和IR 相關，但結論存在爭議。如有研究顯示，在青少年男性中，GAS6 基因rs8191974 位點 A 等位基因和 rs8191973 位點 C 等位基因攜帶者的腰圍、BMI、IL-6 和 hs-CRP 水平低于GG基因型，同樣Axl基因rs2304232位點A等位基因攜帶者的IL-6、胰島素及HOMA-IR 水平低于GG 基因型。提示肥胖和炎癥的易感性可能與GAS6 基因rs8191974、rs8191973 及 Axl 基因 rs2304232 位點的GG 基因型存在相關性［14］。但對亞洲成年人的研究卻未發現肥胖與GAS6 基因多態性存在相關性［15］。本研究發現，T2DM 組 GAS6 基因 rs8191974 位點 GG基因型頻率高于對照組，而GA 和AA 基因型頻率低于對照組，但三種基因型HbA1c、FPG、HOMA-IR 比較差異無統計學意義，而GG 基因型血漿GAS6 水平比GA、AA 基因型低。因此，推測昆明漢族T2DM 患者 GAS6 基因 rs8191974 位點 GA、AA 基因型攜帶者發生T2DM的風險比GG基因型攜帶者低。

有研究顯示，成年女性血漿GAS6 水平與胰島素敏感性存在相關性，與腰圍、腰臀比（WHR）、BMI、HOMA-IR、IL-6 水平呈負相關；然而，在成年男性中卻未發現血漿GAS6 水平與上述指標有相關性，原因可能為性激素對GAS6/TAM 系統的潛在調節作用［16-17］。不同人群中血漿 GAS6 與炎癥、肥胖、IR 的相關性有差異，考慮可能與性別、年齡及性激素等因素有關。目前多項研究結果顯示，血漿GAS6 水平與血糖水平呈負相關［17-20］，因此，糖尿病與 GAS6 基因多態性有關，血漿GAS6 水平對肥胖、IR、糖代謝及炎癥的發生也有影響［14，21-23］。而本研究發現，血漿GAS6水平與HbA1c、FPG、HOMA-IR無相關性，考慮T2DM 是一種遺傳異質性疾病，遺傳和環境因素共同參與、相互作用導致疾病的發生。因此，研究結果的不一致可能與種族和地域的異質性及實驗方法、樣本量等因素有關。

綜上所述，昆明地區漢族T2DM 患者的GG 基因型頻率、G 等位基因頻率高，而GA、AA 基因型頻率及A 等位基因頻率低，且其血漿GAS6 水平低。T2DM 是一種多基因遺傳病，其遺傳基礎不能用單個基因效應來解釋。因此，為進一步闡明GAS6 基因多態性及其血漿水平與T2DM 的關系，還需進行多中心臨床研究，收集不同種族和區域的人群，加大樣本含量，使研究結果更科學、更全面。