吲哚美辛對大鼠跟腱創(chuàng)傷后異位骨化的影響及機(jī)制

謝成龍，齊新文，安榮澤，尤彬，譚偉源，葉燕彬

1 黔西南州人民醫(yī)院，貴州興義562400；2 遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬（珠海）醫(yī)院；3 德陽市第二人民醫(yī)院；4 惠東縣人民醫(yī)院

異位骨化（HO）是指在正常情況下不具有骨化性質(zhì)的組織中出現(xiàn)具有成熟板層骨結(jié)構(gòu)的骨組織，多發(fā)于髖臼骨折、肘及膝肩關(guān)節(jié)骨折脫位損傷后［1］。臨床以肘部及髖部HO 較為常見。HO 是人工髖關(guān)節(jié)置換后最常見并發(fā)癥［2］，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動度下降、關(guān)節(jié)僵硬、畸形、周圍神經(jīng)卡壓和壓力性潰瘍等［3-4］，影響患者正常工作及生活。但HO 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確［5-6］。骨硬化蛋白（SO）是由SOST 基因編碼的一種分泌型糖蛋白［7-8］，對成骨細(xì)胞分化、礦化及骨密度、骨強(qiáng)度均具有抑制作用。由此可以推測，SO 在HO 形成中起一定作用，但相關(guān)研究較少。吲哚美辛作為非甾體消炎藥（NSAIDS）的代表藥物，是目前公認(rèn)的預(yù)防人工髖關(guān)節(jié)置換和髖臼骨折術(shù)后HO 的最有效藥物［9］。鑒于此，2017 年 1 月—2018 年1 月，本研究通過建立大鼠跟腱損傷模型，探討吲哚美辛對創(chuàng)傷后HO 的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為臨床診斷、預(yù)防和治療HO提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級SD雄性大鼠30只，5～6 周齡，體質(zhì)量（132.0 ± 6.5）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證：SCXK（粵）2013-0002，在相同環(huán)境下喂養(yǎng)，室溫約25 ℃，濕度55%，定期紫外線消毒鼠房。吲哚美辛購自廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，將吲哚美辛膠囊內(nèi)粉末混溶于生理鹽水，配置2 mL溶液。大鼠Sclerostin酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自武漢基因美科技有限公司，0.01 mol/L pH6.0枸櫞鈉緩沖液購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司，水合氯醛購自上海化學(xué)試劑公司，離心機(jī)購自湖南湘西醫(yī)學(xué)設(shè)備公司，-20 ℃低溫冰箱購自青島海爾公司，高壓鍋購自上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司，酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2 動物分組及模型構(gòu)建 30 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將其隨機(jī)分為藥物組、模型組、對照組各10只。各組分別行左小腿拍片，排除干擾實(shí)驗(yàn)的異常情況。藥物組和模型組大鼠采用跟腱切斷法誘導(dǎo)HO模型［10］。10%水合氯醛按0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，于大鼠左后小腿跟部剪毛、消毒、備皮，再予碘酊、乙醇消毒后在無菌條件下，切開皮膚及皮下組織至跟腱，沿跟腱中點(diǎn)處橫行切斷，在斷裂跟腱兩端用止血鉗反復(fù)鉗夾5次，跟腱不予縫合，充分止血后以慶大霉素鹽水沖洗術(shù)口，4號絲線縫合切口。對照組僅切開皮膚、皮下組織，暴露跟腱，但未切斷跟腱。造模第1天，藥物組給予吲哚美辛10 mg/（kg·d）強(qiáng)制灌胃，模型組與對照組給予同等體積生理鹽水強(qiáng)制灌胃，均1 次/d，連續(xù)干預(yù)4 周。模型制備過程中死亡大鼠5只，給予相應(yīng)補(bǔ)充。1周左右大鼠傷口愈合良好，無紅腫、傷口裂開等現(xiàn)象。

1.3 X 線檢查 分別于造模第5、10 周取兩組大鼠予10%水合氯醛按0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，用X線片檢查大鼠左后肢正位片，觀察大鼠跟腱HO情況。分級標(biāo)準(zhǔn)［11］：無骨化病灶為0級；骨化病灶密度低為Ⅰ級；骨化病灶成高密度影，邊界欠清為Ⅱ級；骨化病灶密度高，邊界清晰為Ⅲ級。HO 的診斷標(biāo)準(zhǔn)為跟腱部位出現(xiàn)密度影。由2名具有副高級及以上職稱放射科醫(yī)師及2名具有副高級及以上職稱骨科醫(yī)師閱片，比較各組HO情況。

1.4 血清SO檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法。分別于造模前及造模第5、10 周清晨抽取各組麻醉下左側(cè)股靜脈血，以EDTA 抗凝管收集血液樣本，4 ℃離心機(jī)離心（3 500 r/min，15 min），將上清液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，按標(biāo)本收集時間分別標(biāo)記，將標(biāo)本放入-20 ℃冰箱內(nèi)保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清SO。試劑盒購自武漢基因美科技有限公司。

1.5 跟腱肉眼觀察 分別于造模第5、10 周X 線片檢查、血清SO檢測后，每組隨機(jī)處死半數(shù)大鼠，切取跟腱組織，肉眼觀察跟腱組織。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；等級資料比較用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher 確切概率法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組造模第5、10 周X 線檢查結(jié)果比較 造模前大鼠均行左小腿跟腱部位X 線檢查均無骨化影。造模第5周，對照組大鼠跟腱均未出現(xiàn)骨化影；模型組大鼠7 只出現(xiàn)骨化影；藥物組2 只出現(xiàn)骨化影，骨化區(qū)域與模型組相比較小且密度較低。造模第10周，對照組大鼠未見骨化影；模型組5 只出現(xiàn)骨化影，骨化均較第5 周時成熟，骨化區(qū)域更大，密度更高；藥物組2只出現(xiàn)骨化影，骨化區(qū)域與模型組相比較小，密度較低。造模第5、10周，與對照組比較，模型組HO 數(shù)量及骨化程度分級均高（P均<0.05）；與模型組比較，藥物組HO 數(shù)量及骨化程度分級均低（P均<0.05）。見表1。

表1 三組造模第5、10周HO數(shù)量及骨化程度分級（只）

2.2 各組造模第5、10 周血清SO 水平比較 造模前各組血清SO 水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）；造模第5、10 周，與對照組比較，模型組血清SO 水平低（P均<0.05）；與模型組比較，藥物組血清SO水平高（P均<0.05）。見表2。

表2 各組血清SO水平比較［pg/mL，（±s）］

表2 各組血清SO水平比較［pg/mL，（±s）］

組別對照組模型組藥物組SO造模前（n=10）281.99±22.64 285.19±18.15 278.79±15.99造模第5周（n=10）284.28±29.72 135.92±11.72 345.65±9.37造模第10周（n=5）280.94±17.15 123.13±25.57 366.76±16.88

2.3 各組造模第5、10 周跟腱肉眼觀察結(jié)果 正常大鼠跟腱為白色，寬約3 mm，厚約2 mm。造模第5周，對照組大鼠跟腱組織中未發(fā)現(xiàn)軟骨樣組織；模型組跟腱斷端腫大增粗呈淺棕黃色，有增生組織相連成條索狀，質(zhì)地硬；藥物組跟腱組織質(zhì)地及體積介于其他兩組間，部分組織中有軟骨樣組織。造模第10周，各組觀察結(jié)果基本與造模第5周時相似，但模型組硬度更大、范圍更廣。

3 討論

HO 在骨科領(lǐng)域比較常見，但發(fā)病機(jī)制不確切。為了解HO 的病因、發(fā)病機(jī)制及治療措施，人們設(shè)計(jì)并探討了許多造模方法。LIN 等［10］建立大鼠跟腱切斷HO 模型并行X 線評估，第3 周未見HO 形成，第5周60%大鼠出現(xiàn)HO，第10 周所有大鼠出現(xiàn)HO。XU 等［11］采用跟腱切斷法誘導(dǎo)HO 模型的實(shí)驗(yàn)研究，在第5、10 周兩個時間點(diǎn)進(jìn)行X 線檢查，發(fā)現(xiàn)模型的成功率較高。本研究采用跟腱切斷法對20 只大鼠誘導(dǎo)HO，模型組在第10 周HO 發(fā)生率為100%。此方法操作簡單，易重復(fù)，該實(shí)驗(yàn)均由同一人對大鼠跟腱施加相同次數(shù)及相同力量的鉗夾造成跟腱損傷，保障創(chuàng)傷程度的相對一致性。大鼠的存活率也較高，造模后l～2 周大鼠均恢復(fù)正常活動。X 線檢查出現(xiàn)骨化影提示HO 形成。于第5 周行X 線檢查提示模型組10只大鼠中有7只出現(xiàn)骨化影，第10周時模型組5只大鼠均出現(xiàn)骨化影。模型組在第5、10周跟腱組織中出現(xiàn)軟骨樣組織。大鼠跟腱切斷法誘導(dǎo)HO 模型可能的成骨機(jī)制是在組織修復(fù)過程中局部炎癥增生，巨噬細(xì)胞聚集并釋放炎癥介質(zhì)刺激間充質(zhì)干細(xì)胞分化；首先是軟骨細(xì)胞增殖和肥大，基質(zhì)鈣化及血管長入，然后通過軟骨化骨的方式形成HO［12］。該動物模型在形態(tài)和放射學(xué)上與創(chuàng)傷所致HO 病理狀態(tài)較為接近，近年來已有較多學(xué)者采用此種HO模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

目前對SO 的研究主要集中在骨質(zhì)疏松以及脊柱骨化等方面。強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者血清SO 水平明顯降低，尤其在AS后期脊柱附著點(diǎn)韌帶骨化后血清SO 水平降低更為明顯。Wnt 信號通路在骨形成方面起重要作用［13］，SO 是 Wnt 信號的阻斷因子，SO 被骨細(xì)胞分泌后通過骨小管到達(dá)成骨細(xì)胞表面后與LRP5 及LRP6 輔助性受體結(jié)合，抑制卷曲蛋白及Wnt 信號與上述受體結(jié)合，從而抑制骨形成［14］。當(dāng)SO 表達(dá)下調(diào)時，對Wnt 通路的阻斷減弱，負(fù)向調(diào)節(jié)骨代謝導(dǎo)致骨密度、骨形成速率和骨骼強(qiáng)度明顯增加，骨過度生長，考慮SO 在韌帶骨化中起著重要作用。SO 作為成骨指標(biāo)，在一定程度上反映HO 的骨化程度。本研究結(jié)果顯示，模型組血清SO 在HO的形成過程中表達(dá)下調(diào)，提示SO 在血循環(huán)中不足，使抑制骨化作用減弱。其機(jī)制可能為骨細(xì)胞中SO蛋白及 SO mRNA 的表達(dá)被抑制，SO 不能與 Wnt 經(jīng)典信號通路的受體結(jié)合，導(dǎo)致Wnt通路抑制解除，從而增加成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化。成骨細(xì)胞的抑制解除，使骨代謝向骨形成方面轉(zhuǎn)化，參與HO 的形成［15］。

影響血清SO 水平下調(diào)的因素有很多，包括激素、機(jī)械刺激、低氧環(huán)境等。在骨折愈合、脊柱韌帶骨化及本次試驗(yàn)中模型組結(jié)果顯示血清SO 水平與對照組相比降低。創(chuàng)傷、炎癥等因素引起血管閉塞或斷裂導(dǎo)致局部供氧途徑發(fā)生阻礙，局部供氧減少或者缺乏［16］，由此可以推測低氧狀態(tài)下SO 水平下降，隨后SO 作用于成骨細(xì)胞的平衡被打破。故SO對成骨細(xì)胞的抑制削弱或者解除，成骨細(xì)胞增殖、分化的功能開啟。能夠影響到SO的物質(zhì)還有很多，比如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、環(huán)氧化酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶等，它們存在協(xié)同或拮抗作用。在本實(shí)驗(yàn)中相同條件下可知，SO水平下調(diào)導(dǎo)致HO形成。

目前臨床上多采用吲哚美辛預(yù)防HO［17］，使用NSAIDS 成功抑制HO 的發(fā)生表明炎性反應(yīng)參與HO形成，同時也說明藥物干預(yù)只有在HO 形成的早期有效；一旦HO 形成后藥物干預(yù)效果較差。吲哚美辛主要通過抑制前列腺素E介導(dǎo)的炎性反應(yīng)來預(yù)防HO 形成；也可以直接抑制間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)在動物模型上給予吲哚美辛預(yù)防HO，結(jié)果顯示用藥后第5、10 周，藥物組較模型組中SO水平高。造模后第5周影像學(xué)X線檢查提示藥物組有2 只出現(xiàn)骨化影，第10 周時2 只大鼠出現(xiàn)骨化影，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明吲哚美辛能夠上調(diào)SO 在大鼠跟腱局部異位骨組織的表達(dá)，阻止成骨活動的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)用吲哚美辛預(yù)防HO 形成，改變了HO 形成的微環(huán)境并抑制了成骨因子的作用。

綜上所述，吲哚美辛可抑制或減緩HO 的形成，其機(jī)制可能與上調(diào)SO 水平有關(guān)。創(chuàng)傷后HO 血清SO 水平可作為一種新的診斷指標(biāo)及反映骨化進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物。未來需探討NSAIDS 類藥物治療HO 過程中相關(guān)蛋白的變化，進(jìn)一步了解NSAIDS 治療HO的機(jī)制。