海南辣椒、櫻桃番茄病毒病調查及病原dot-ELISA鑒定

嚴婉榮，趙志祥，肖彤斌，張善學，文香玲，王會芳

（1.海南省農業(yè)科學院植物保護研究所，海南 海口 571100；2.海南正業(yè)中農高科股份有限公司，海南 海口 571100）

【研究意義】2018年海南省冬季蔬菜種植面積257 728 hm2,產量566.77萬t，其中辣椒種植面積408 96 hm2，產量101.52萬t（據《海南統計年鑒-2019》），櫻桃番茄種植面積約7 822 hm2，產量28.15萬t左右［1］。辣椒大面積種植主要集中在瓊海、澄邁、文昌、臨高等縣市，是供應內地冬季“菜籃子”的第一大蔬菜品類［2］。櫻桃番茄俗稱“圣女果”，重點產區(qū)分布在陵水、定安、東方、昌江等縣市，僅陵水就占全省種植面積的69%。2016年，“陵水圣女果”獲國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局“國家地理標志保護產品”認證［1］。隨著辣椒和櫻桃番茄多年連作、較高的復種指數以及海南優(yōu)越的天氣條件，導致病蟲害發(fā)生嚴重。尤其病毒病在辣椒和櫻桃番茄上普遍發(fā)生，陵水、定安主產區(qū)出現的病毒病對櫻桃番茄生產造成了毀滅性的影響［3］，使產量和品質明顯下降，嚴重影響了種植效益和農戶生產積極性。【前人研究進展】國內外報道的辣椒病毒已有70種以上，我國報道的已達31種［4］，侵染番茄的病毒至少有136種［5］,我國報道的已達34種［4］。海南地區(qū)陸續(xù)也有新病毒發(fā)現，首次在海南辣椒上檢測到辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）［6］和甜椒脈斑駁病毒（Pepper veinal mottle virus,PVMV）［7］,首次在海南番茄上發(fā)現了番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）［8］。在優(yōu)勢毒源上，姚玉榮等報道海南辣椒的優(yōu)勢毒源為黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）［9］，嚴婉榮等［10］檢測表明辣椒上的優(yōu)勢毒源為CMV和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV），番茄上的優(yōu)勢毒源為番茄黃花曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）和CMV［10］，除CMV外，辣椒環(huán)斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）、PVMV、ChiVMV 3種病毒已成為海南辣椒上不可忽視的毒源［7］，番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）［11］和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）［12］已在云南番茄種植區(qū)大面積發(fā)生，海南地區(qū)應引起高度重視和警惕。【本研究切入點】通過全面系統調查，明確10個市縣辣椒和櫻桃番茄病毒病發(fā)生為害情況。通過dot-ELISA方法，對CMV、TMV、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus,BBWV）、黃瓜綠斑駁病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）進行檢測，明確其變化動態(tài)。【擬解決的關鍵問題】進一步明確病毒病的種類及侵染情況，為病害的診斷、藥劑的篩選及綜合防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 海南辣椒、櫻桃番茄病毒病發(fā)生、為害程度調查

2018—2019年，對海口市瓊山區(qū)、澄邁縣永發(fā)鎮(zhèn)、定安縣定城鎮(zhèn)深田村、臨高縣加來鎮(zhèn)賢郎村，五指山市番陽鎮(zhèn)、昌江縣十月田鎮(zhèn)、陵水縣光坡鎮(zhèn)武山村、三亞市吉陽區(qū)、瓊海市潭門鎮(zhèn)福田村和東方市感城鎮(zhèn)10個市縣的辣椒、櫻桃番茄病毒病發(fā)生情況進行了抽樣調查分析，調查了不同地點、不同作物時期病毒病的為害程度。每個調查田塊采用五點取樣法，每點取不同方位植株30株，每個田塊共計調查150株，記錄病害發(fā)生株數，觀察每株的發(fā)病程度，辣椒病情級數調查參照《農藥田間藥效試驗準則 第9部分殺菌劑防治辣椒病毒病》（NY/T 1464.9-2007），番茄病情級數調查參照《農藥田間藥效試驗準則 第8部分殺菌劑防治番茄病毒病》（NY/T 1464.8-2007）。計算病毒病田間發(fā)病率和病情指數，并進行癥狀類型歸類和統計分析。

1.2 辣椒、櫻桃番茄病毒病dot-ELISA檢測

1.2.1辣椒、櫻桃番茄樣本采集 在海口市、定安縣、臨高縣、陵水縣等市縣采集到辣椒病毒病葉片樣本288份，櫻桃番茄病毒病葉片樣本305份。

1.2.2辣椒、櫻桃番茄樣本dot-ELISA檢測稱取葉片1 g，加入10 mL 0.01 mol/L PBS研磨，8 000 r/min離心3 min；取2 uL上清點到硝酸纖維素膜（NC膜）上，室溫干燥10 min后將NC膜浸入到100 mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中溫室封閉30 min；NC膜放入5%脫脂奶粉1∶5 000倍稀釋的單抗中室溫孵育60 min,PBST洗膜4次,每次3 min；NC膜放入用5%的脫脂奶粉1∶8 000倍稀釋的堿性磷酸酶標記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育60 min，PBST洗膜5次，每次5 min,PBS洗膜1次，5 min;用濾紙吸干膜，放入底物顯色液中反應5～20 min，清水中漂洗后觀察結果。底物顯色液：顯色底物NBT 66 uL和 BCIP 33 μL加到10 mL底物緩沖液（0.1 mol/L Tris-Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5）中混勻。檢測對象包括CMV、TMV、TuMV、BBWV和CGMMV。其中NC膜購自Amersham 公司，貨號RPN303C。Anti-Mouse IgG二抗購自Sigma公司，貨號A3562。顯色底物BCIP/NBT購自Promega公司，貨號S3771。部分一抗和試驗方法由浙江大學農業(yè)與生物技術學院謝艷老師提供。每種病毒的陽性對照和陰性對照購自北京萊特生物試劑公司。

2 結果與分析

2.1 病毒病發(fā)生、為害程度調查結果

10個市縣辣椒和櫻桃番茄病毒病發(fā)病率和病情指數見表1，調查結果顯示：10個市縣的癥狀類型主要以斑駁花葉，頂部葉片皺縮卷曲，黃花及矮縮（叢枝）為主（圖1），斑駁花葉和頂部葉片皺縮卷曲癥狀在田間分布較均勻，植株矮縮斑駁、黃花癥狀多分布在田塊邊緣地區(qū)。在定點調查的10個地點中，陵水縣光坡鎮(zhèn)武山村和定安縣定城鎮(zhèn)深田村的櫻桃番茄病毒病發(fā)生情況最為嚴重，病害發(fā)生率在10%～98%，病情指數在2.89～40.78，其周邊地區(qū)也有大面積感染病毒病，田間煙粉虱發(fā)生嚴重，可能是導致病毒大面積爆發(fā)的主要傳毒媒介［13-14］。臨高縣加來鎮(zhèn)賢郎村和瓊海潭門鎮(zhèn)福田村的辣椒病毒病發(fā)生也比較嚴重，病害發(fā)生率在18%～75%，病情指數在4.44～25.69，田間薊馬爆發(fā)，可能是導致病毒病發(fā)生的主要傳毒媒介［15］，海口瓊山和東方感城種植的櫻桃番茄和辣椒病毒病發(fā)生均較輕，病害發(fā)生率在3%～15%，病情指數在0.78～5.22（表1）。藥劑防治結果均不理想，尤其在櫻桃番茄上，一旦發(fā)生病毒病，傳播速度很快，無藥可治。不同區(qū)域病毒病發(fā)生情況不同，不同時間段病情也有差異，前期的調查發(fā)現從苗期到開花期之前病毒病發(fā)生情況較少，只有臨高、瓊海的辣椒和陵水的櫻桃番茄有少量病害發(fā)生，發(fā)病率最高只有3%，開花期到掛果期病毒病發(fā)生情況較嚴重。

表1 辣椒、櫻桃番茄病毒病發(fā)生情況Table 1 The occurrence of pepper and cherry tomato virus diseases

2.2 dot-ELISA檢測結果

辣椒樣本288份，來自海口市、澄邁縣、瓊海市、三亞市、五指山市、東方市和臨高縣。CMV、TMV、TuMV、BBWV、CGMMV的檢出率分別為20.14%、7.98%、6.25%、4.17%、2.08%。其中CMV+TMV復合侵染4份，CMV+TMV+TuMV復合侵染3份，CMV+TMV+BBWV復合侵染1份，總體病毒檢出率為37.5%，復合侵染率為2.08%（表2）。臨高地區(qū)辣椒病毒檢出率最高，達到41.38%，瓊海地區(qū)檢出率達到39.73%，東方地區(qū)檢出率最小為21.05%。

櫻桃番茄樣本305份，來自海口市、澄邁縣、定安縣、文昌市、陵水縣。CMV、TMV、TuMV、BBWV、CGMMV的檢出率分別為11.48%、3.94%、3.61%、1.64%、0.66%，其中CMV+TMV復合侵染2份，CMV+BBWV復合侵染1份，總體病毒檢出率為20.33%，復合侵染率為0.98%。定安和陵水地區(qū)的櫻桃番茄病毒檢出率較高，分別達到25.61%和25.51%，文昌地區(qū)檢出率最低為8.33%，檢測部分結果見圖2。在檢測的5種病毒中，辣椒和櫻桃番茄的優(yōu)勢毒源均為CMV和TMV。采集的辣椒和櫻桃番茄樣本中，所有樣本均表現出病毒癥狀，但大部分樣本沒有檢測到病毒，可能與病毒檢測種類不夠多、檢測方法及病毒變異有關。

表2 辣椒、櫻桃番茄dot-ELISA檢測結果Table 2 dot-ELISA test results of pepper and cherry tomato

3 討論

在檢測的5種目標病毒中，辣椒和櫻桃番茄的優(yōu)勢毒源仍為CMV和TMV，與車海彥等［12］和嚴婉榮等［10］的檢測結果一致。在檢出率上，本研究辣椒和櫻桃番茄中CMV和TMV的檢出率遠低于車海彥等［12］和嚴婉榮等［10］的檢出率。辣椒上BBWV的檢測情況卻完全相反，2015年檢出率只有0.04%，本次檢測結果高達4.17%。番茄上2015年BBWV的檢出率為2.77%，本次檢測結果為1.64%，呈下降趨勢。可能與檢測方法、采樣地點及病毒逐年變化有關。省外地區(qū)，洛陽辣椒中CMV的檢出率只有3.03%，番茄CMV的檢出率高達45.54%［16］，貴州地區(qū)辣椒中CMV、TMV、TuMV、BBWV的檢出率分別為18.58%、4.35%、0.40%、0.79%，番茄中CMV、TMV、TuMV、BBWV的檢出率分別為14.77%、0.57%、1.14%、1.14%，均未檢測到CGMMV,存在6種類型的復合侵染［17］，除番茄中CMV的檢測結果高于本研究的檢測結果外，其他病毒的檢測均低于本研究的檢測結果，而且本研究CGMMV在辣椒和番茄中均有檢測到，為在海南地區(qū)的首次報道。在優(yōu)勢病毒上，于海龍等［18］在全國16個省市采集辣椒樣本，通過雙抗體夾心酶聯免疫吸附反應（DAS-ELISA）對12種辣椒樣本進行檢測，PMMoV和CMV為優(yōu)勢毒源，其中海南地區(qū)的7個樣本中也只檢測出2份PMMoV和2份CMV。廣西地區(qū)辣椒病毒病的優(yōu)勢毒源為ChiVMV、PVMV、CMV［19］。湖北地區(qū)茄科蔬菜上毒源復雜，CMV、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）和BBWV是主要毒源［20］。陳靈芝等檢測的甘肅辣椒中優(yōu)勢毒源為TMV，但未檢測到CMV［21］。山東辣椒上的優(yōu)勢毒源為PMMoV、CMV和甜菜西方黃化病毒（Beet western yellows virus，BWYV）［22］，河南省由煙粉虱傳播的TYLCV和ToCV在番茄主栽區(qū)普遍發(fā)生［14］。北京地區(qū)番茄上的優(yōu)勢毒源為TYLCV、TMV和CMV［23］。除CMV在全國各省普遍發(fā)生外，其他種類的優(yōu)勢毒源各有特點，本研究中由于檢測種類的局限性，大部分樣品表現病毒癥狀但并未檢測到病毒，針對全國已報道的各省優(yōu)勢毒源，下一步將擴大病毒檢測范圍，除繼續(xù)監(jiān)測本研究中的幾種病毒外，加大對辣椒上ChiVMV、PVMV、PMMoV、ChiRSV以及番茄上TYLCV、ToCV、TSWV、ToMV的檢測。在檢測方法上，采用小RNA深度測序和RT-PCR相結合的技術繼續(xù)對海南地區(qū)辣椒和櫻桃番茄病毒發(fā)生情況進行跟蹤調查和全面檢測，為有效藥劑的研發(fā)與篩選、抗病品種的選育、進一步有針對性防控病毒病提供科學依據。

4 結論

本研究調查了海南辣椒和櫻桃番茄病毒病總體發(fā)生情況，明確了辣椒和櫻桃番茄主要種植病毒病發(fā)生率和病情指數。通過dot-ELISA方法對病毒樣本進行檢測，明確了288份辣椒樣本和305份櫻桃番茄樣本中5種病毒病的總體檢出率和復合侵染率。比較了2015年嚴婉榮等［10］通過DAS-ELISA方法和本次通過dot-ELISA對CMV、TMV、TuMV、BBWV 4種病毒檢測結果的異同。同時與全國各省市辣椒和番茄病毒病發(fā)生情況進行了比較，明確了海南省與其他省市病毒檢出率、復合侵染以及優(yōu)勢毒源的異同。綜上所述，近2年海南省辣椒和和櫻桃番茄主產區(qū)病毒病為害十分嚴重，病毒種類日趨增多，復合侵染現象日趨嚴重，病毒的檢測和優(yōu)勢毒源的預測可更好地為抗病品種的篩選、靶標藥劑的研發(fā)及病毒病綜合防控提供策略。