云南省雙江縣4種多足搖蚊翅膀形態特征及COI基因序列分析

楊紹昌，浦朝忠，何于雯，孟錦昕，李楠，王靜林*

(1.云南省畜牧獸醫科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224； 2.雙江縣畜牧獸醫技術推廣中心，云南 雙江 677399；3.雙江縣勐勐鎮農業農村服務中心，云南 雙江 677399)

搖蚊科昆蟲(Chironomidae)屬于昆蟲綱、有翅亞綱、雙翅目、長角亞目[1]。2012年全世界已經記錄了11個亞科400多個屬6300多種搖蚊[2,3]。在中國目前已記錄有大約1000種搖蚊，分布在長足搖蚊亞科、直突搖蚊亞科、原寡角搖蚊亞科、寡角搖蚊亞科、寡脈搖蚊亞科、濱海搖蚊亞科、搖蚊亞科等7個亞科，139個屬[4]。搖蚊在全球地理分布區域非常廣泛，其幼蟲在淡水水體中種類最多。搖蚊在環境監測、水產品良好的天然餌料及養殖等方面具有較好運用前景[5-7]；部分搖蚊為農業害蟲，不僅危害蓮藕，還會捕食仔魚，并傳播疾病[8]。因此，對搖蚊的系統研究、環境評價、水產品養殖等方面具有重要意義。為此，2020年4月筆者在云南省雙江縣采集搖蚊，采用形態學和分子生物學方法對采集到的4種搖蚊進行了鑒定，報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集及初步分類

2020年4月23日18:00至次日8：00在云南省雙江縣布京村大勐峨組一黃牛養殖場牛圈內采用燈誘方法(功夫小帥，12V， 300mA， 湖北武漢)進行昆蟲標本采集[9]。將采集到的標本放入-20℃冰箱中冷凍致昆蟲死亡，在體視顯微鏡下挑選出搖蚊，并根據形態特征對搖蚊進行初步鑒定，并進行計數，不同形態搖蚊標本放入1.5mL離心管加入1mL 70%乙醇浸泡，編號，4℃保存。

1.2 搖蚊形態學鑒定

從離心管中取出搖蚊標本，切下昆蟲翅膀，在光學顯微鏡下觀察昆蟲形態學特征。蟲體加入200μL消化液，40℃金屬浴放置過夜[10]。

1.3 DNA提取及PCR擴增

用DNA提取試劑盒(天根公司)按說明書從上述消化液中提取搖蚊基因組DNA，取2μL 搖蚊基因組DNA做模板，依次加入2.5μL 10×Buffer、2μL 2.5mmol/L dNTP、0.5μL COI基因上游引物[11]、0.5μL COI基因下游引物[11]、9.5μL 去離子水，參照文獻方法進行PCR擴增。1%瓊脂糖電泳檢查擴增條帶，PCR擴增陽性產物送北京擎科新業生物技術有限公司(昆明測序部)進行測序。

1.4 序列分析

分別使用DNA Star軟件中SeqMan和MegAlign進行序列拼接和核苷酸同源性分析。使用MEGA X 軟件構建最大似然法(ML)系統進化樹，篩選DNA最佳模型，bootstrap值為1000。

2 結果

2.1 搖蚊采集

2020年4月23日在云南省雙江縣布京村大勐峨組黃牛養殖場采集到搖蚊160只，其中雌搖蚊151只(94.4%)、雄搖蚊9只(5.6%)。

2.2 形態學鑒定

采集的160只搖蚊身體黑色，翅膀上均有明顯的淡色和暗色斑塊，按翅膀上淡斑和暗斑的形態、大小、位置，把采集到的160只搖蚊分為4類，第一類(以SJ2為代表)翅面有4個大小不等、不規則、明顯的暗斑(見圖1 A)，第1個暗斑較大，位于中1室靠近基部1/4處，暗斑下緣超過中2脈；第2個暗斑較小，位于中2室中部，暗斑下緣不超過中3+4脈；第3個暗斑成矩形，覆蓋中肘叉并超過肘1脈抵達翅下緣；第4個暗斑上緣覆蓋肘2脈，向下覆蓋臀室中部，但下緣未抵達翅下緣。 第二類(以SJ26為代表)翅面有4個大小不等、不規則、明顯的暗斑(見圖1 B)，第1個、第3個暗斑位置大小形態與SJ2相似；第4個暗斑位置與SJ2相似，但形態與SJ2有明顯區別，呈不規則形；第2個暗斑為長條形，上緣起于中1脈，暗斑前端開始于靠近基部2/10處向后到達7/10處，暗斑下緣與中3+4脈形成一白色條帶。第三類(以SJ22為代表)翅面有4個大小不等、不規則、明顯的暗斑(見圖1 C)，第1個、第3個和第4個暗斑位置大小形態與SJ2相似；第2個暗斑位置與SJ2相似，但比SJ2大，暗斑端部明顯，靠近基部有點模糊。第四類(以SJ24為代表)翅面有5個大小不等、不規則、明顯的暗斑(見圖1 D)，第1個、第2個、第3個和第4個暗斑位置大小形態與SJ26相似，但在中1室端部還存有一個顏色較淺的暗斑。

A.SJ2；B.SJ26；C.SJ22；D.SJ24。

2.3 搖蚊分子鑒定

2.3.1核苷酸同源性分析

分別選取雙江縣采集到的不同形態的11只搖蚊(編號分別為SJ1、SJ2、SJ3、SJ19、SJ20、SJ21、SJ22、SJ23、SJ24、SJ25、SJ26)進行昆蟲COI基因擴增，序列測定分別獲得每只搖蚊437個核苷酸(nt)序列。同源性分析結果顯示，雙江縣采集的11只搖蚊COI基因核苷酸同源性在84%～100%，其中SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊COI基因核苷酸同源性在99.3%～100%，而與其他5只搖蚊核苷酸同源性均低于86%；SJ21和SJ22兩只搖蚊核苷酸同源性為97.7%，而與其他9只搖蚊核苷酸同源性均低于87%；SJ25和SJ26兩只搖蚊核苷酸同源性為99.8%，而與其他9只搖蚊核苷酸同源性均低于90.2%；SJ2與SJ25和SJ26核苷酸同源性最高僅為89.9%～90.2%，而與其他8只搖蚊核苷酸同源性均低于87%。11只搖蚊COI基因核苷酸與GenBank中20種27條已知搖蚊相應序列一起進行分析(見表1)，SJ2與2013年在云南省勐海縣采集的、2011年在浙江衢州采集的以及2013年在日本茨城采集的P.japonicum核苷酸同源性最高在91.5%～99.5%，而與其他搖蚊核苷酸同源性均在90.6%以下；SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊與2014年在云南省勐臘縣采集的Polypedilumsp3 SC(KU497064)核苷酸同源性最高在99.3%～100%，而與其他已發現搖蚊核苷酸同源性均低于89%；SJ21和SJ22兩只搖蚊與2013年云南省勐海縣采集的Polypedilumsp2 SC(KU497084)、Polypedilumsp2 SC (KU497066)和Polypedilumsp2 SC (KU497059)搖蚊核苷酸同源性最高在97.3%～99.5%，其次與2015年在廣西河池采集的Polypedilumsp2 SC (KU497090)較高核苷酸同源性最高在92.7%～94.1%，而與其他搖蚊核苷酸同源性均在89.7%以下； SJ25和SJ26兩只搖蚊與2013年在云南省勐海縣采集的P.scalaenum核苷酸同源性最高在97.3%～97.9%，而與其他搖蚊核苷酸同源性均低于90.6%。

表1 云南省雙江縣4種搖蚊COI基因核苷酸序列同源性分析

2.3.2COI基因系統進化分析

將11只搖蚊COI基因與GenBank 中不同搖蚊種類相應基因27條序列一起構建ML系統進化樹，選用GTL+G+I模型為最佳DNA模型，在系統進化樹上雙江縣采集的11只搖蚊與選用的22條多足搖蚊屬(Polypedilum)搖蚊位于同一較大的進化分支內，提示本次在雙江縣采集到的搖蚊均為多足搖蚊屬搖蚊。進一步分析發現本次雙江縣采集的11只多足搖蚊屬搖蚊分別位于4個進化分支內， SJ2與4條P.japonicum序列形成同一進化分支；SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊與Polypedilumsp3 SC(KU497064)搖蚊序列形成同一進化分支；SJ21和SJ22兩只搖蚊與Polypedilumsp2 SC(KU497084)、Polypedilumsp2 SC (KU497066)、Polypedilumsp2 SC (KU497059)和Polypedilumsp2 SC (KU497090)搖蚊序列形成同一進化分支；SJ25和SJ26兩只搖蚊與P.scalaenum搖蚊序列形成同一進化分支(見圖2)。以上分析結果提示SJ2搖蚊可能是P.japonicum，SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊可能是與Polypedilumsp3 SC(KU497064)相同種類的搖蚊，SJ21和SJ22兩只搖蚊是與Polypedilumsp2 SC(KU497084、KU497066、KU497059) 相同種類的搖蚊，SJ25和SJ26兩只搖蚊可能是P.scalaenum搖蚊。

2.4 分類鑒定結果

采用形態學和分子生物學方法明確采集搖蚊種類后，對采集到的160只搖蚊進行分類(見表2)，結果顯示存在4種多足搖蚊屬搖蚊，其中多足搖蚊屬Polypedilumsp3 SC搖蚊為優勢種，占全部采集搖蚊數量的81.25%；其次為與Polypedilumsp2 SC(KU497084)種類相似的多足搖蚊屬搖蚊，占全部采集搖蚊數量的11.25%，P.japonicum和P.scalaenum兩種搖蚊數量較少，僅占全部采集搖蚊數量的7.5%。

采用最大似然法(ML)構建系統進化樹，最佳模型選用(GTR+G+I)；圓點代表本次采集到搖蚊標本。

表2 云南省雙江縣黃牛養殖場搖蚊種群構成

3 討論

本研究在雙江縣采集到的搖蚊翅面上均有明顯的淡、暗斑，根據暗斑數量、形態、位置、大小分為4類，同樣COI基因序列分析結果也顯示了翅面上形態學上不同的4類搖蚊也分別位于不同的4個進化分支內，提示本次在雙江縣采集的搖蚊可能為4個不同的種類。進一步分析結果顯示SJ2與P.japonicum遺傳進化關系密切，SJ1、SJ3、SJ19、SJ20、SJ23、SJ24等6只搖蚊與Polypedilumsp3 SC遺傳進化關系密切，SJ21和SJ22兩只搖蚊與Polypedilumsp2 SC遺傳進化關系密切，而SJ25和SJ26兩只搖蚊與P.scalaenum遺傳進化關系密切，提示云南省雙江縣存在P.japonicum、Polypedilumsp3 SC、Polypedilumsp2 SC和P.scalaenum等4種多足搖蚊屬搖蚊。

本次雙江縣采集到的4種多足搖蚊屬搖蚊，除P.japonicum翅面有5個暗斑外，P.sp3 SC、P.sp2 SC和P.scalaenum均有4個暗斑，中1室、中肘叉-肘1脈、臀室暗斑形態、位置相似，僅靠這3個暗斑難于區分，這3種多足搖蚊屬搖蚊主要依據中2室暗斑大小、位置、形態的不同來進行區分。因此，中2室暗斑是形態學鑒定P.sp3 SC、P.sp2 SC和P.scalaenum等搖蚊種類的重要特征。

目前，在世界上已經發現了8個亞屬520種多足搖蚊屬(PolypedilumKieffer，1912)搖蚊，該屬搖蚊地理分布范圍非常廣泛[12]。在中國目前已經發現多足搖蚊屬搖蚊大約90種[13]。近年來，在云南省西雙版納州勐海縣和勐臘縣以及保山市高黎貢山等地區的調查中共發現了P.japonicum、P.scalaenum、P.tsukubaense、P.xianjuensis、P.asakawaense、P.nubifer、P.yongsanensis、P.genpeiense、P.cochlearum、P.spathum、P.decematoguttatum、P.heberti、P.cf.okigrandis、P.cf.alticola、P.bingoparadoxum、P. 8SC、P.sp4SC、P. 6SC、P.sp5SC、P.sp2SC、P.sp3 SC等21種多足搖蚊屬搖蚊[12,14]。本研究再次在云南省臨滄市雙江縣布京村大勐峨組黃牛養殖場采集到了P.japonicum、P.scalaenum、P.sp3 SC 、P.sp2 SC等4種多足搖蚊屬搖蚊，表明了這幾種多足搖蚊屬搖蚊在云南省南部邊境地區分布較為廣泛。

雙江縣位于云南省西南部，氣溫較高，氣候濕潤，植被較好，有利于多種昆蟲存在和繁殖。搖蚊與蠓蟲外形相似，常常被誤認為不吸血蠓蟲[12]。本次研究在雙江縣大勐峨村黃牛養殖場采集蠓蟲中，同時采集到一些體型相似、翅面上具有淡暗斑的昆蟲，經形態學和分子生物學鑒定為4種多足搖蚊屬搖蚊。該研究不僅豐富了我國搖蚊種類資源，也對搖蚊生態學、水產品天然餌料及養殖、水體污染、農業危害等方面進一步的研究具有重要意義。