p16/Ki-67細胞雙染對HR-HPV陽性的宮頸高級別鱗狀上皮內病變的預測價值*

東 蓓，周素芳，張 璇

蘇州高新區人民醫院婦產科，江蘇蘇州 215129

宮頸癌在發展中國家病死率較高，及時診治宮頸高級別鱗狀上皮內病變(HSIL)在一定程度可預防該病[1-3]。宮頸鱗狀上皮內病變(SIL)與高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)感染密切相關[4-8]。

目前，臨床初篩SIL主要采取宮頸液基細胞薄層技術(TCT)和HR-HPV檢測，但均存在不足[9]。TCT特異度高，靈敏度低，缺乏統一的質控標準。HR-HPV檢測靈敏度高，特異度低，不能預判宮頸病變及程度。p16/Ki67相對表達水平與宮頸病變級別具有直接相關性，p16/Ki-67細胞雙染特異度高,靈敏度與HR-HPV近似，具有良好的應用前景。本研究對HR-HPV陽性者進行p16/Ki-67細胞雙染、TCT檢測及陰道鏡下宮頸活檢，探討p16/Ki-67細胞雙染對HSIL的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年7月至2019年7月在本院門診接受宮頸癌篩查HR-HPV檢測陽性患者為研究對象。納入標準：(1)HR-HPV陽性；(2)患者同意該研究并簽署知情同意書。排除標準：(1)既往接受過SIL或宮頸癌治療；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并妊娠；(4)患者拒絕簽署知情同意書。該研究已獲得本院倫理委員會批準(編號：[2016]第013號)。

1.2方法

1.2.1實驗方案 根據納入、排除標準，受試者均進行p16/Ki-67細胞雙染、TCT及陰道鏡下宮頸活檢。

1.2.2HR-HPV檢測 宮頸脫落細胞用多功能SLAN-96 S醫用PCR系統(上海宏石公司)進行HR-HPV DNA檢測，包括13種HR-HPV型別，分別為HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型。根據試劑說明進行檢測，HR-HPV任一型別陽性即診斷為HR-HPV陽性。

1.2.3p16/Ki-67細胞雙染檢測 收集的宮頸脫落細胞保存至盛有新柏氏的瓶中，采用ThinPrep 2000系統(美國Hologic公司)進行處理。采用p16/Ki-67檢測試劑盒(亞能生物公司)，根據試劑說明進行染色并判讀結果。研究結果由專業檢驗技師進行觀察、分析，并將顯微鏡下的觀察畫面以圖片方式進行保存和記錄。p16/Ki-67細胞雙染將p16陽性定義為胞質棕染和(或)胞核棕染，Ki-67陽性定義為胞核紅染。如在同一細胞中同時出現胞質棕染和胞核紅染，無論染色深度高低和表達水平強弱，均視為p16/Ki-67陽性[10-11]。

1.2.4TCT檢測 TCT采用ThinPrep 2000制片機(北京豪洛捷公司)進行檢測，結果以Bethesda系統為依據，分為無上皮內病變或惡性病變(NILM)、意義不明的不典型鱗狀細胞(ASCUS)、非典型鱗狀細胞、不除外高級別鱗狀上皮內病變、不典型腺細胞、低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)、HSIL、鱗癌、原位腺癌和腺癌。本研究將TCT判讀結果ASCUS以下者定義為TCT結果陰性，ASCUS及以上者為陽性。

1.2.5陰道鏡下宮頸活檢 受試者在p16/Ki-67細胞雙染、TCT采樣后1個月內，由高級職稱同一醫生進行陰道鏡檢查。3%醋酸和1%復方碘液涂抹宮頸，可疑病灶取活檢，如無明顯可疑病灶，取3、6、9、12點活檢，轉化區暴露不滿意者行宮頸管搔刮術。病理結果也由2名高級職稱病理醫生進行判讀。結果分為：慢性炎或見挖空細胞、LSIL(CIN 1)、HSIL(CIN2～3)及以上。

2 結 果

2.1一般情況 共有297例具有完整資料的患者納入本研究，年齡29～67歲，平均(48.87±7.68)歲。組織病理學結果顯示，慢性炎或見挖空細胞占總例數的56.90%(169/297)；LSIL患者占26.26%(78/297)；HSIL及以上者占16.84%(50/297)，其中鱗癌2例。p16/Ki-67細胞雙染總陽性率為32.66%(97/297)。TCT提示ASCUS及以上者占21.55%(64/297)。見表1。

2.2不同病理結果中p16/Ki-67的陽性率 慢性炎或見挖空細胞中p16/Ki-67的陽性率為9.47%(16/169)；LSIL陽性率為41.03%(32/78)；HSIL及以上陽性率為94.00%(47/50)，其中鱗癌陽性率為100.00%(2/2)。組織病理學結果HSIL及以上：p16/Ki-67雙染的靈敏度為98.00%，特異度為80.56%，陽性似然比為5.16，陰性似然比為0.02。根據p16/Ki-67細胞雙染檢測結果繪制ROC曲線，p16/Ki-67細胞雙染的ROC曲線下面積為0.905(95%CI：0.872～0.978)。見表1。

2.3不同病理結果中TCT的陽性率 本研究中，TCT結果ASCUS及以上者為11.78%(35/297)。組織病理學診斷結果HSIL及以上：TCT的靈敏度為70.00%，特異度為88.23%，陽性似然比為5.80，陰性似然比為0.34。繪制ROC曲線，TCT的曲線下面積為0.850(95%CI：0.772～0.928)。

2.4p16/Ki-67細胞雙染與TCT比較 p16/Ki-67細胞雙染的靈敏度和特異度均較高，且靈敏度高于TCT。p16/Ki-67細胞雙染曲線下面積較TCT大(0.905>0.850)，p16/Ki-67細胞雙染與TCT在HSIL的檢測陽性率進行比較，差異有統計學意義(χ2=14.583，P<0.001)。見表1。

表1 p16/Ki-67細胞雙染和TCT在不同組織病理學結果中的表達(n)

續表1 p16/Ki-67細胞雙染和TCT在不同組織病理學結果中的表達(n)

3 討 論

研究發現，超過99%的宮頸癌是由HR-HPV持續感染所致[12]。生物學標志物在當今臨床研究中扮演著越來越重要的作用，p16的半衰期較短，具有細胞周期素依賴性，在細胞周期中發揮重要的抑癌作用。相關研究顯示，在宮頸癌形成過程中，E7作為HPV的癌蛋白，也是確立和維持惡性表型的必要因素，由于E7介導的PRb功能性失活，導致p16水平過度表達[13]。因此，p16被認為是HPV感染的替代性標志物，與HR-HPV的致癌活性具有直接相關性。

Ki-67是一種核內蛋白，與細胞分裂增殖具有直接相關性，其相對表達水平可在一定程度上反映細胞增殖活躍程度。研究表明，在Ki-67表達于G0期以外的所有細胞周期中，過度表達p16的細胞只有在細胞周期調控機制受損后才會活躍增殖，在正常生理條件下，同一細胞內不能同時表達Ki-67和p16[14]。因此，細胞內同時表達Ki-67和p16可作為細胞周期調控失常的標志，當雙染陽性出現時，則意味著可能出現HSIL。由于 p16/Ki-67細胞雙染的理論基礎在于抗體與抗原的特異性結合,具有可重復性和客觀性，不易被主觀因素所影響，因此，有助于取得更加客觀的診斷結果[15]。

本研究中，p16/Ki-67細胞雙染陽性率隨著病理結果異常度的升高而升高，這與其他相關研究結論一致[16-17]。p16/Ki-67細胞雙染和TCT的ROC曲線下面積分別為0.905(95%CI：0.872～0.978)及0.850(95%CI：0.772～0.928)。p16/Ki-67細胞雙染的曲線下面積較TCT大(0.905>0.850)。研究結果顯示，針對HSIL檢測而言，p16/Ki-67細胞雙染HSIL檢測陽性率優于TCT。兩者進行χ2檢驗，結果顯示，p16/Ki-67雙染與TCT比較，差異有統計學意義(χ2=14.583，P<0.001)。這一結果與廖光東等[18]對62例HR-HPV陽性婦女進行p16/Ki-67細胞雙染預測宮頸病變的報道相一致。

本研究中病理結果HSIL及以上者TCT的靈敏度為70.00%，特異度為88.23%，與相關研究提示TCT客觀性較差，假陰性率、假陽性率為5%～50%的結果并不一致[19]。究其原因，可能與本次試驗樣本量較小及TCT檢查結果判讀的主觀因素有關。

此外，研究發現，p16/Ki-67細胞雙染及TCT陽性似然比分別為5.16、5.80，陰性似然分別比0.02、0.34。研究結果提示，p16/Ki-67細胞雙染對HISL的陰性預測價值優于TCT。該結果與吳憂等[20]對251例細胞學診斷為ASCUS及以上的患者進行p16/Ki-67細胞雙染的結論一致。

臨床上對HSIL初篩主要采取TCT和HR-HPV檢測，2種技術在診斷靈敏度和特異度方面均存在一定的不足。而本研究采用的p16/Ki-67細胞雙染診斷HSIL具有較高的靈敏度和特異度。因此，在臨床實踐中，可以考慮選取HR-HPV聯合p16/Ki-67細胞雙染進行宮頸癌初篩，以盡可能減少漏診及診治過度。