血漿SEPT9基因甲基化在結(jié)直腸癌根治術(shù)后復發(fā)監(jiān)測中的應(yīng)用

趙雅霞

陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，重慶 400038

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，隨著我國老齡化的加劇和飲食結(jié)構(gòu)的變化，其發(fā)病率逐年增加，在全部惡性腫瘤中排第3位[1-4]。 結(jié)直腸癌患者早期癥狀不顯著，但隨著腫瘤組織的不斷生長，會逐漸壓迫周邊器官組織，導致腹瀉、便秘、排便習慣改變、便血和腹痛等，隨著病情的逐漸加重，患者還有可能出現(xiàn)腸腔狹窄、梗阻、貧血和惡病質(zhì)等癥狀，嚴重威脅患者身體健康[5-6]。目前臨床多采用以早期手術(shù)為主的綜合治療方案，早期診斷尤為重要。常用的診斷方法有糞便免疫化學試驗(FIT)、癌胚抗原(CEA)檢測和糞便隱血試驗(FOBT)[7-9]。FIT和FOBT價格低，操作方便，但是容易受到其他腸道疾病的影響，因此，特異度比較低；CEA作為大腸癌蛋白標志物，靈敏度和特異度均較低。近期國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，血漿SEPT9基因甲基化(mSEPT9)在結(jié)直腸癌早期診斷中有較高的靈敏度和特異度，有望成為結(jié)直腸癌診斷的早期指標[10-12]。為明確血漿mSEPT9檢測在結(jié)直腸癌患者術(shù)后復發(fā)監(jiān)測中的效果，本研究通過回顧性分析，對血漿mSEPT9檢測在結(jié)直腸癌患者術(shù)后復發(fā)監(jiān)測中的應(yīng)用價值進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年4月至2018年4月在本院行結(jié)直腸癌根治術(shù)的154例結(jié)直腸癌患者作為研究對象。其中男79例，女75例；年齡38～80歲，平均(62.39±11.26)歲；TNM Ⅰ期18例，Ⅱ期82例，Ⅲ期54例。納入標準：(1)于本院就診且首次經(jīng)過結(jié)腸鏡或病理活檢確診為結(jié)直腸癌的患者，未進行相關(guān)的治療；(2)于本院接受規(guī)范化結(jié)直腸癌手術(shù)治療；(3)所有病例資料完整，包括病理、病史和實驗室檢測相關(guān)指標。排除標準：(1)伴有其他惡性腫瘤；(2)伴風濕性關(guān)節(jié)炎、腎病綜合征等免疫系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2方法 應(yīng)用回顧性分析法對所有研究對象的年齡、性別和TNM分期等一般資料進行分析，并在患者行根治術(shù)后進行為期2年的跟蹤調(diào)查。

1.2.1血漿mSEPT9檢測 利用Epipro Colon Plasma Quick試劑盒對所有患者經(jīng)處理后的外周血標本進行游離DNA提取，經(jīng)裂解、洗滌、洗脫后獲得100 μL游離DNA，洗脫液加入150 μL亞硫酸鹽溶液和25 μL保護液在80 ℃恒溫箱中保存45 min，與磁珠結(jié)合后3次洗滌磁珠，室溫干燥后加入60 μL洗脫液，在23 ℃下洗脫亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA。應(yīng)用Epi proColon2.0試劑盒在美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)的ABI7500 PCR儀上進行血漿mSEPT9 V2區(qū)檢測，在15 μL PCR預反應(yīng)液中加入15 μL經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA標本，行三重平行PCR測試。測試結(jié)果根據(jù)試劑盒說明書進行判定，當三重平行PCR測試中兩重及以上的mSEPT9循環(huán)閾值(Ct值)<45時，表示判定結(jié)果為陽性[13-14]。

1.2.2血清CEA檢測 應(yīng)用德國Roche公司生產(chǎn)的CEA檢測試劑盒在同公司生產(chǎn)的Elecsys 2010分析儀上進行CEA檢測，結(jié)果根據(jù)試劑盒說明書進行評定，當CEA≥5 ng/mL時，表示判定結(jié)果為陽性。

1.3評定標準 以全部154例患者術(shù)前的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、發(fā)生部位、血管是否侵犯、脈管是否侵犯、TNM分期、術(shù)后復發(fā)等一般資料及病理特征作為標準，分析患者血漿mSEPT9檢測結(jié)果同上述一般資料及病理特征數(shù)據(jù)間的關(guān)系。所有患者術(shù)前和術(shù)后均行血漿mSEPT9檢測，且患者術(shù)后2年隨訪期間均每隔3個月進行1次復查，并對患者的血漿mSEPT9和血清CEA進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)直腸癌患者術(shù)前一般資料及病理特征同血漿mSEPT9檢測結(jié)果間的關(guān)系 154例患者術(shù)前血漿mSEPT9檢測陽性率為70.13%(108/154)，其中TNM Ⅰ期陽性率為44.44%(8/18)，Ⅱ期陽性率為63.41%(52/82)，Ⅲ期陽性率為88.89%(48/54)。隨著患者TNM分期的提高，血漿mSEPT9檢測陽性率也隨之升高，且Ⅰ、Ⅱ期患者陽性率均低于Ⅲ期(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿mSEPT9檢測陽性率為95.89%，明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者(46.91%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但患者術(shù)前血漿mSEPT9檢測陽性率在不同年齡、性別、BMI、發(fā)生部位、血管是否侵犯、脈管是否侵犯間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者術(shù)前一般資料及病理特征同血漿mSEPT9檢測結(jié)果間的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表1 結(jié)直腸癌患者術(shù)前一般資料及病理特征同血漿mSEPT9檢測結(jié)果間的關(guān)系[n(%)]

2.2結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后血漿mSEPT9檢測結(jié)果比較 154例患者術(shù)后血漿mSEPT9檢測陽性率為7.79%(12/154)，與術(shù)前[70.13%(108/154)]比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=123.213 7，P<0.001)。

2.3結(jié)直腸癌患者術(shù)后復發(fā)情況及血漿mSEPT9檢測和血清CEA檢測差異比較 經(jīng)過2年的隨訪發(fā)現(xiàn)，154例患者中有46例(29.87%)復發(fā)，復發(fā)患者的血清CEA檢測陽性率為41.30%(19/46)，血漿mSEPT9檢測陽性率為80.43%(37/46)，復發(fā)患者的血漿mSEPT9檢測陽性率要高于血清CEA檢測(χ2=13.188 5，P=0.000 3)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是臨床上較常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，病因尚不明確，但一般認為同疾病因素、遺傳因素和不良飲食習慣等密切相關(guān)。吳東等[7]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌在我國惡性腫瘤疾病中發(fā)病率和病死率居第3～5位，具有病死率高和預后差等特點。有研究發(fā)現(xiàn)，我國每天結(jié)直腸癌患者新發(fā)例數(shù)超過25萬，死亡例數(shù)約為14萬，新發(fā)和死亡例數(shù)占全世界同期病例的20%左右[15-17]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者死亡率在各類消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌。從世界范圍來說，我國的結(jié)直腸癌發(fā)生率較低，但近幾年隨著飲食習慣的改變和生活壓力的增加，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈增加趨勢[18-20]。蔡克銀等[21]研究發(fā)現(xiàn)，由于我國人們生活方式和飲食習慣的改變，結(jié)直腸癌已成為我國增長速度最快的惡性腫瘤之一。徐峰等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)，近年來，我國結(jié)直腸癌發(fā)生率和病死率呈上升趨勢，嚴重威脅人們的身體健康。目前，臨床上外科根治術(shù)仍是結(jié)直腸癌患者的首選治療手段，有助于患者生命的延長。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者根治術(shù)后復發(fā)率在30%～50%，是導致患者術(shù)后死亡的主要原因之一[23-25]。因此，對結(jié)直腸癌患者的術(shù)后復發(fā)風險進行評估，對預防患者疾病復發(fā)，延長患者生命有重要意義。堵一喬等[26]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌作為嚴重威脅人類健康的消化道腫瘤疾病，CEA、糞便隱血試驗和結(jié)腸鏡檢等診斷方式雖較常見，但存在靈敏度低和特異度不高等缺陷，無法準確判斷患者有無轉(zhuǎn)移或復發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸鏡檢雖然是結(jié)直腸癌診斷的“金標準”，但因其有創(chuàng)傷性易導致患者出現(xiàn)腸道穿孔等不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到限制[27]。因此，尋求更加精確有效的結(jié)直腸癌復發(fā)風險監(jiān)測方式十分重要。

SEPT9位于染色體17q25.3上，在細胞分裂末期有重要作用，參與腫瘤新生血管生成和細胞增殖。目前在多種惡性腫瘤如宮頸癌、乳腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌中發(fā)現(xiàn)SEPT9基因處于過表達狀態(tài)，具有促癌作用[28-30]。近幾年，隨著醫(yī)學診斷技術(shù)的不斷進步，大量研究發(fā)現(xiàn)外周血mSEPT9檢測技術(shù)在結(jié)直腸癌篩查中具有較高的靈敏度和特異度。丁清清等[31]研究發(fā)現(xiàn)，mSEPT9監(jiān)測具有極高的靈敏度和特異度，有助于人群腸癌篩查依從性的提升。張立營等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，SEPT9基因的5′調(diào)控序列中存在CpG島，結(jié)直腸癌患者患病過程中約有90%的患者SEPT9基因中的該序列發(fā)生甲基化。金鵬[33]的研究也發(fā)現(xiàn)，SEPT9基因的表達調(diào)控機制非常復雜，雖未完全明確但SEPT9基因的過甲基化仍可作為早期結(jié)直腸癌檢測的分子標志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者術(shù)前血漿mSEPT9檢測陽性率在不同年齡和性別間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與患者的TNM分期情況有著直接的關(guān)系，患者分期等級越高血漿mSEPT9檢測陽性率越高；且結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后的血漿mSEPT9檢測陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿mSEPT9檢測陽性率為95.89%，明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移患者(46.91%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是患者術(shù)前血漿mSEPT9檢測陽性率在不同年齡、性別、BMI、發(fā)生部位、血管是否侵犯、脈管是否侵犯間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明血漿mSEPT9檢測結(jié)果可以作為評價結(jié)直腸癌手術(shù)療效的標準。賀娜等[11]的研究表明，結(jié)直腸癌患者血漿mSEPT9檢測陽性率明顯升高，與本研究一致。因有研究證明結(jié)直腸癌患者術(shù)后血清CEA水平的升高是患者復發(fā)轉(zhuǎn)移的風險因素[34]，本文對比了術(shù)后復發(fā)患者的血清CEA結(jié)果與血漿mSEPT9結(jié)果，發(fā)現(xiàn)血漿mSEPT9檢測陽性率要高于血清CEA檢測陽性率(P<0.05)，說明血漿mSEPT9檢測結(jié)果可以作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后復發(fā)檢測的分子標志物。趙慧霞等[35]和郁迪等[36]研究均發(fā)現(xiàn)，mSEPT9能夠作為結(jié)直腸癌特異的分子標志物。也有研究表明，mSEPT9具有良好的大腸癌檢出性能，可用于大腸癌篩查[37-38]。且mSEPT9檢測方便，重復性高，為結(jié)直腸癌的早期診斷干預提供了有力證據(jù)。當然，楊宏宇等[39]研究也表明，mSEPT9在結(jié)直腸癌檢測中存在一定的不足，檢測結(jié)果易受多種因素的影響。因此，臨床檢測過程中應(yīng)注意檢測環(huán)境的質(zhì)量控制，盡量避免外界因素影響檢測結(jié)果。由于本研究為回顧性研究，且屬于單中心研究，納入樣本量有限，下一步將展開大樣本多中心的臨床研究，進一步觀察mSEPT9檢測在結(jié)直腸癌早期診斷及預后中的價值。

綜上所述，血漿mSEPT9不僅可以作為檢測結(jié)直腸癌患者手術(shù)療效的標準，還可以作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后復發(fā)檢測的分子標志物。