血漿SEPT9基因甲基化在結直腸癌根治術后復發監測中的應用

趙雅霞

陸軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科，重慶 400038

結直腸癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，隨著我國老齡化的加劇和飲食結構的變化，其發病率逐年增加，在全部惡性腫瘤中排第3位[1-4]。 結直腸癌患者早期癥狀不顯著，但隨著腫瘤組織的不斷生長，會逐漸壓迫周邊器官組織，導致腹瀉、便秘、排便習慣改變、便血和腹痛等，隨著病情的逐漸加重，患者還有可能出現腸腔狹窄、梗阻、貧血和惡病質等癥狀，嚴重威脅患者身體健康[5-6]。目前臨床多采用以早期手術為主的綜合治療方案，早期診斷尤為重要。常用的診斷方法有糞便免疫化學試驗(FIT)、癌胚抗原(CEA)檢測和糞便隱血試驗(FOBT)[7-9]。FIT和FOBT價格低，操作方便，但是容易受到其他腸道疾病的影響，因此，特異度比較低；CEA作為大腸癌蛋白標志物，靈敏度和特異度均較低。近期國內外研究發現，血漿SEPT9基因甲基化(mSEPT9)在結直腸癌早期診斷中有較高的靈敏度和特異度，有望成為結直腸癌診斷的早期指標[10-12]。為明確血漿mSEPT9檢測在結直腸癌患者術后復發監測中的效果，本研究通過回顧性分析，對血漿mSEPT9檢測在結直腸癌患者術后復發監測中的應用價值進行探討，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年4月至2018年4月在本院行結直腸癌根治術的154例結直腸癌患者作為研究對象。其中男79例，女75例；年齡38～80歲，平均(62.39±11.26)歲；TNM Ⅰ期18例，Ⅱ期82例，Ⅲ期54例。納入標準：(1)于本院就診且首次經過結腸鏡或病理活檢確診為結直腸癌的患者，未進行相關的治療；(2)于本院接受規范化結直腸癌手術治療；(3)所有病例資料完整，包括病理、病史和實驗室檢測相關指標。排除標準：(1)伴有其他惡性腫瘤；(2)伴風濕性關節炎、腎病綜合征等免疫系統疾病。本研究經本院倫理委員會批準。

1.2方法 應用回顧性分析法對所有研究對象的年齡、性別和TNM分期等一般資料進行分析，并在患者行根治術后進行為期2年的跟蹤調查。

1.2.1血漿mSEPT9檢測 利用Epipro Colon Plasma Quick試劑盒對所有患者經處理后的外周血標本進行游離DNA提取，經裂解、洗滌、洗脫后獲得100 μL游離DNA，洗脫液加入150 μL亞硫酸鹽溶液和25 μL保護液在80 ℃恒溫箱中保存45 min，與磁珠結合后3次洗滌磁珠，室溫干燥后加入60 μL洗脫液，在23 ℃下洗脫亞硫酸鹽轉化的DNA。應用Epi proColon2.0試劑盒在美國Applied Biosystems公司生產的ABI7500 PCR儀上進行血漿mSEPT9 V2區檢測，在15 μL PCR預反應液中加入15 μL經亞硫酸鹽轉化的DNA標本，行三重平行PCR測試。測試結果根據試劑盒說明書進行判定，當三重平行PCR測試中兩重及以上的mSEPT9循環閾值(Ct值)<45時，表示判定結果為陽性[13-14]。

1.2.2血清CEA檢測 應用德國Roche公司生產的CEA檢測試劑盒在同公司生產的Elecsys 2010分析儀上進行CEA檢測，結果根據試劑盒說明書進行評定，當CEA≥5 ng/mL時，表示判定結果為陽性。

1.3評定標準 以全部154例患者術前的年齡、性別、體質量指數(BMI)、淋巴結轉移、發生部位、血管是否侵犯、脈管是否侵犯、TNM分期、術后復發等一般資料及病理特征作為標準，分析患者血漿mSEPT9檢測結果同上述一般資料及病理特征數據間的關系。所有患者術前和術后均行血漿mSEPT9檢測，且患者術后2年隨訪期間均每隔3個月進行1次復查，并對患者的血漿mSEPT9和血清CEA進行檢測。

2 結 果

2.1結直腸癌患者術前一般資料及病理特征同血漿mSEPT9檢測結果間的關系 154例患者術前血漿mSEPT9檢測陽性率為70.13%(108/154)，其中TNM Ⅰ期陽性率為44.44%(8/18)，Ⅱ期陽性率為63.41%(52/82)，Ⅲ期陽性率為88.89%(48/54)。隨著患者TNM分期的提高，血漿mSEPT9檢測陽性率也隨之升高，且Ⅰ、Ⅱ期患者陽性率均低于Ⅲ期(P<0.05)。淋巴結轉移患者血漿mSEPT9檢測陽性率為95.89%，明顯高于淋巴結未轉移患者(46.91%)，差異有統計學意義(P<0.05)，但患者術前血漿mSEPT9檢測陽性率在不同年齡、性別、BMI、發生部位、血管是否侵犯、脈管是否侵犯間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 結直腸癌患者術前一般資料及病理特征同血漿mSEPT9檢測結果間的關系[n(%)]

續表1 結直腸癌患者術前一般資料及病理特征同血漿mSEPT9檢測結果間的關系[n(%)]

2.2結直腸癌患者手術前后血漿mSEPT9檢測結果比較 154例患者術后血漿mSEPT9檢測陽性率為7.79%(12/154)，與術前[70.13%(108/154)]比較，差異有統計學意義(χ2=123.213 7，P<0.001)。

2.3結直腸癌患者術后復發情況及血漿mSEPT9檢測和血清CEA檢測差異比較 經過2年的隨訪發現，154例患者中有46例(29.87%)復發，復發患者的血清CEA檢測陽性率為41.30%(19/46)，血漿mSEPT9檢測陽性率為80.43%(37/46)，復發患者的血漿mSEPT9檢測陽性率要高于血清CEA檢測(χ2=13.188 5，P=0.000 3)。

3 討 論

結直腸癌是臨床上較常見的消化系統惡性腫瘤疾病，病因尚不明確，但一般認為同疾病因素、遺傳因素和不良飲食習慣等密切相關。吳東等[7]研究發現，結直腸癌在我國惡性腫瘤疾病中發病率和病死率居第3～5位，具有病死率高和預后差等特點。有研究發現，我國每天結直腸癌患者新發例數超過25萬，死亡例數約為14萬，新發和死亡例數占全世界同期病例的20%左右[15-17]。臨床研究發現，結直腸癌患者死亡率在各類消化系統惡性腫瘤疾病中僅次于胃癌、食管癌和原發性肝癌。從世界范圍來說，我國的結直腸癌發生率較低，但近幾年隨著飲食習慣的改變和生活壓力的增加，我國結直腸癌發病率呈增加趨勢[18-20]。蔡克銀等[21]研究發現，由于我國人們生活方式和飲食習慣的改變，結直腸癌已成為我國增長速度最快的惡性腫瘤之一。徐峰等[22]的研究也發現，近年來，我國結直腸癌發生率和病死率呈上升趨勢，嚴重威脅人們的身體健康。目前，臨床上外科根治術仍是結直腸癌患者的首選治療手段，有助于患者生命的延長。有研究發現，結直腸癌患者根治術后復發率在30%～50%，是導致患者術后死亡的主要原因之一[23-25]。因此，對結直腸癌患者的術后復發風險進行評估，對預防患者疾病復發，延長患者生命有重要意義。堵一喬等[26]研究發現，結直腸癌作為嚴重威脅人類健康的消化道腫瘤疾病，CEA、糞便隱血試驗和結腸鏡檢等診斷方式雖較常見，但存在靈敏度低和特異度不高等缺陷，無法準確判斷患者有無轉移或復發。研究發現，結腸鏡檢雖然是結直腸癌診斷的“金標準”，但因其有創傷性易導致患者出現腸道穿孔等不良反應，臨床應用受到限制[27]。因此，尋求更加精確有效的結直腸癌復發風險監測方式十分重要。

SEPT9位于染色體17q25.3上，在細胞分裂末期有重要作用，參與腫瘤新生血管生成和細胞增殖。目前在多種惡性腫瘤如宮頸癌、乳腺癌和頭頸部鱗狀細胞癌中發現SEPT9基因處于過表達狀態，具有促癌作用[28-30]。近幾年，隨著醫學診斷技術的不斷進步，大量研究發現外周血mSEPT9檢測技術在結直腸癌篩查中具有較高的靈敏度和特異度。丁清清等[31]研究發現，mSEPT9監測具有極高的靈敏度和特異度，有助于人群腸癌篩查依從性的提升。張立營等[32]的研究發現，SEPT9基因的5′調控序列中存在CpG島，結直腸癌患者患病過程中約有90%的患者SEPT9基因中的該序列發生甲基化。金鵬[33]的研究也發現，SEPT9基因的表達調控機制非常復雜，雖未完全明確但SEPT9基因的過甲基化仍可作為早期結直腸癌檢測的分子標志物。本研究結果發現，結直腸癌患者術前血漿mSEPT9檢測陽性率在不同年齡和性別間差異無統計學意義(P>0.05)，但與患者的TNM分期情況有著直接的關系，患者分期等級越高血漿mSEPT9檢測陽性率越高；且結直腸癌患者手術前后的血漿mSEPT9檢測陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，淋巴結轉移患者血漿mSEPT9檢測陽性率為95.89%，明顯高于淋巴結未轉移患者(46.91%)，差異有統計學意義(P<0.05)，但是患者術前血漿mSEPT9檢測陽性率在不同年齡、性別、BMI、發生部位、血管是否侵犯、脈管是否侵犯間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，說明血漿mSEPT9檢測結果可以作為評價結直腸癌手術療效的標準。賀娜等[11]的研究表明，結直腸癌患者血漿mSEPT9檢測陽性率明顯升高，與本研究一致。因有研究證明結直腸癌患者術后血清CEA水平的升高是患者復發轉移的風險因素[34]，本文對比了術后復發患者的血清CEA結果與血漿mSEPT9結果，發現血漿mSEPT9檢測陽性率要高于血清CEA檢測陽性率(P<0.05)，說明血漿mSEPT9檢測結果可以作為結直腸癌患者術后復發檢測的分子標志物。趙慧霞等[35]和郁迪等[36]研究均發現，mSEPT9能夠作為結直腸癌特異的分子標志物。也有研究表明，mSEPT9具有良好的大腸癌檢出性能，可用于大腸癌篩查[37-38]。且mSEPT9檢測方便，重復性高，為結直腸癌的早期診斷干預提供了有力證據。當然，楊宏宇等[39]研究也表明，mSEPT9在結直腸癌檢測中存在一定的不足，檢測結果易受多種因素的影響。因此，臨床檢測過程中應注意檢測環境的質量控制，盡量避免外界因素影響檢測結果。由于本研究為回顧性研究，且屬于單中心研究，納入樣本量有限，下一步將展開大樣本多中心的臨床研究，進一步觀察mSEPT9檢測在結直腸癌早期診斷及預后中的價值。

綜上所述，血漿mSEPT9不僅可以作為檢測結直腸癌患者手術療效的標準，還可以作為結直腸癌患者術后復發檢測的分子標志物。