IBD患病人群腸道菌群分布特征及其與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的關(guān)系

李冬盎，馬曉芬，曲湉湉，李 歡

海軍第九七一醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東青島 266102

炎癥性腸病(IBD)是一組包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)在內(nèi)的腸道慢性炎癥性疾病，患者主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹脹、腹痛、腹瀉、大便異常(黏液稀便、黏液膿便、膿血便、血水樣便等)及發(fā)熱，部分患者還會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、皮疹等各種腸外表現(xiàn)[1]。當(dāng)前，我國(guó)IBD患者數(shù)量不斷增加，發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。IBD的病因目前尚不清楚，絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其可能與遺傳、免疫、環(huán)境、腸道微生態(tài)等因素密切相關(guān)，尤其是腸道微生態(tài)紊亂的臨床表現(xiàn)及相關(guān)作用機(jī)制逐漸受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注[2-3]。無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外都建議在治療IBD時(shí)根據(jù)患者整體病情變化，尤其是病變累及部位和病情嚴(yán)重程度采用個(gè)體化治療方案，但目前臨床上所應(yīng)用的評(píng)估患者疾病活動(dòng)性的治療均存在一定局限性[4]。免疫炎癥相關(guān)蛋白復(fù)合物(IIRPCs)是存在于人體血清中的一種與機(jī)體炎癥、免疫和補(bǔ)體系統(tǒng)有關(guān)的蛋白質(zhì)，參與機(jī)體系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)、細(xì)菌清除及腸道免疫的穩(wěn)態(tài)[5]。髓過(guò)氧化酶(MPO)是一類存在于中性粒細(xì)胞中與細(xì)胞浸潤(rùn)程度有關(guān)的酶，在評(píng)價(jià)組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度和炎癥發(fā)生方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MPO活性變化能通過(guò)對(duì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況的調(diào)節(jié)來(lái)改變結(jié)腸炎患者炎性反應(yīng)情況和臨床癥狀，可用于結(jié)腸炎等感染性疾病、腸道有關(guān)疾病的診斷、病情評(píng)估、治療效果及預(yù)后評(píng)價(jià)[6]。維生素D1-α羥化酶(CYP27B1)是循環(huán)形式維生素D轉(zhuǎn)化為有活性的1,25二羥基維生素D3(1,25-OH2-D3)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，而維生素D的缺乏也被指出與免疫相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，這其中就包括IBD[7]。本文探討IBD患病人群腸道菌群分布特征與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的變化，并進(jìn)一步對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2020年4月在本院消化科門診和住院治療的106例IBD患者作為病例組，其中UC患者58例作為UC組，CD患者48例作為CD組；選取同期在本院接受治療的60例非IBD腸道疾病患者作為疾病對(duì)照組；另選取在本院同期進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查的60例體檢健康者作為健康對(duì)照組。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2012，廣州)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)年齡18～60周歲；(3)經(jīng)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、組織病理檢查、內(nèi)鏡檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查等均確診。病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期患有上消化道糜爛、潰瘍或感染性胃腸病；(2)30 d內(nèi)服用非甾體類抗炎藥、益生菌制劑、他汀類、維生素D制劑等藥物；(3)合并免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病；(4)合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、原發(fā)性甲狀腺功能亢進(jìn)等可能引起嚴(yán)重維生素D代謝紊亂的相關(guān)疾病；(5)有腸道手術(shù)史；(6)無(wú)法行全結(jié)腸鏡檢查。疾病對(duì)照組患者就診時(shí)均表現(xiàn)出不同程度的腹痛、發(fā)熱、腹瀉等，經(jīng)結(jié)腸鏡檢查排除IBD。健康對(duì)照組研究對(duì)象均經(jīng)病史詢問(wèn)和體格檢查無(wú)消化道相關(guān)疾病，無(wú)自身免疫病史、其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史，近期未使用可能影響本研究結(jié)果的相關(guān)藥物。病例組中男72例，女34例；年齡20～58歲，平均(42.29±5.93)歲；其中緩解期組32例，活動(dòng)期組74例，活動(dòng)期組包括輕度活動(dòng)期組21例，中度活動(dòng)期組32例，重度活動(dòng)期組21例。疾病對(duì)照組中男43例，女17例；年齡18～60歲，平均(41.06±7.92)歲；其中小腸炎癥16例，小腸潰瘍19例，慢性結(jié)腸炎20例，結(jié)腸癌5例。健康對(duì)照組中男41例，女19例；年齡18～56歲，平均(40.94±7.15)歲。各組研究對(duì)象年齡、性別等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，患者和(或)家屬均知情，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集 收集所有研究對(duì)象的相關(guān)臨床資料，包括基本信息、診斷、疾病活動(dòng)性評(píng)估、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、結(jié)腸鏡檢查結(jié)果等。UC患者疾病活動(dòng)性評(píng)估應(yīng)用改良Mayo評(píng)分評(píng)價(jià)[9]，評(píng)分≤2分且每個(gè)單項(xiàng)評(píng)分均超過(guò)1分為緩解期，否則為活動(dòng)期，其中>2～5分為輕度活動(dòng)期，>5～10分為中度活動(dòng)期，>10～12分為重度活動(dòng)期。CD患者疾病活動(dòng)性評(píng)估應(yīng)用Harvey-Bradshaw指數(shù)評(píng)價(jià)[10]，評(píng)分≤4分為緩解期，>4分為活動(dòng)期，其中>4～8分為中度活動(dòng)期，>8分為重度活動(dòng)期。

1.2.2標(biāo)本采集與儲(chǔ)存 采集所有受試者結(jié)腸鏡檢查當(dāng)天的空腹血液標(biāo)本和新鮮糞便標(biāo)本5～10 g，血液標(biāo)本于4 ℃下3 000 r/min離心10 min后采集上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)；新鮮糞便標(biāo)本置于無(wú)菌密閉的便盒中，常溫下0.5 h內(nèi)送檢。

1.2.3血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平檢測(cè) 取保存的血清標(biāo)本，應(yīng)用Native-PAGE電泳方法進(jìn)行血清蛋白電泳，以人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物水平對(duì)IIRPCs、CYP27B1水平進(jìn)行相對(duì)定量，應(yīng)用Umax Powerlook 2100XL Scanner凝膠掃描儀進(jìn)行凝膠掃描，應(yīng)用美國(guó)Bio-Rad公司的Quantity One 軟件計(jì)算標(biāo)本中的IIRPCs和CYP27B1的水平；采用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)血清MPO水平，在日立7180全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，MPO試劑盒購(gòu)自北京九強(qiáng)生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4腸道菌群檢測(cè) 取0.5 g新鮮糞便標(biāo)本，10倍法稀釋。選擇腸球菌、腸桿菌、消化球菌、擬桿菌、酵母菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定和檢測(cè)，選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。采用需氧培養(yǎng)基培養(yǎng)腸球菌、腸桿菌和酵母菌，采用厭氧菌培養(yǎng)基對(duì)其他細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度均為37 ℃，時(shí)間分別為24 h和72 h。細(xì)菌鑒定應(yīng)用法國(guó)生物梅里埃公司的半自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，用每克糞便中含有菌數(shù)的log CFU/g表示菌落數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對(duì)象腸道菌群數(shù)量比較 UC、CD組患者的腸道腸球菌、腸桿菌、消化球菌、擬桿菌、酵母菌數(shù)量較健康對(duì)照組和疾病對(duì)照組均明顯增加，而乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌則明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UC組和CD組腸道各菌群數(shù)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。106例IBD患者中，緩解期與活動(dòng)期患者上述腸道菌群數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重度活動(dòng)期患者與輕度、中度活動(dòng)期患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，輕度活動(dòng)期患者與中度活動(dòng)期患者比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 UC組、CD組、健康對(duì)照組、疾病對(duì)照組腸道菌群數(shù)量比較

表2 IBD患者緩解期組、輕度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組、重度活動(dòng)組腸道菌群數(shù)量比較

2.2各組研究對(duì)象血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較 UC、CD組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明顯高于健康對(duì)照組和疾病對(duì)照組(P<0.05)。UC組與CU組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。106例IBD患者中，緩解期與活動(dòng)期IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；重度活動(dòng)期患者與輕度、中度活動(dòng)期患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輕度活動(dòng)期組患者與中度活動(dòng)期組患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 UC組、CD組、健康對(duì)照組、疾病對(duì)照組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較

表4 IBD患者緩解期組、輕度活動(dòng)組、中度活動(dòng)組、重度活動(dòng)組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較

2.3IBD患者腸道菌群數(shù)量與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，IBD患者的血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平與腸道腸球菌、腸桿菌、擬桿菌、酵母菌數(shù)量呈正相關(guān)(P<0.05)，與乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與真桿菌和消化球菌數(shù)量無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 IBD患者腸道菌群數(shù)量與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的相關(guān)性分析

3 討 論

腸道菌群是IBD發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)重要內(nèi)容。研究指出，人體的腸道中含有數(shù)量巨大的可影響腸黏膜免疫系統(tǒng)功能的細(xì)菌，其能使有IBD遺傳易感性個(gè)體的腸道免疫反應(yīng)發(fā)生異常，進(jìn)而可能誘發(fā)IBD[2]。腸道菌群包含中性菌、有害菌和益生菌，是人體腸道微生態(tài)的重要組成部分。不同菌群在正常生理?xiàng)l件下處于一個(gè)平衡狀態(tài)，互相依存和制約，發(fā)揮其生物屏障作用。而一旦這種平衡被打破，腸道菌群處于紊亂狀態(tài)時(shí)，就會(huì)引起腸道功能異常，繼而引發(fā)疾病。IBD的發(fā)病中，腸道菌群成分的存在不可或缺。有研究對(duì)對(duì)照組、UC組和CD組的腸道菌群分布情況進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，UC、CD患者腸道雙歧桿菌數(shù)量顯著減少，消化球菌、真桿菌明顯增加[11]。本研究結(jié)果顯示，UC、CD組患者的腸道腸球菌、腸桿菌、消化球菌、擬桿菌、酵母菌數(shù)量較健康對(duì)照組和疾病對(duì)照組均明顯增加，而乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌則明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；UC組和CD組腸道各菌群數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示IBD患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)，表現(xiàn)出以乳酸桿菌、雙歧桿菌為代表的益生菌數(shù)量的減少和以腸球菌、腸桿菌等為代表的條件致病菌數(shù)量的增加。進(jìn)一步比較不同疾病活動(dòng)性患者的腸道菌群分布顯示，緩解期與活動(dòng)期患者上述腸道菌群數(shù)量比較也存在明顯差異，其中重度活動(dòng)期患者與輕度、中度活動(dòng)期患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，輕度活動(dòng)期患者與中度活動(dòng)期患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示與其他非IBD腸道疾病患者和健康人群比較，IBD患者存在明顯的的腸道微生態(tài)失衡，且與其疾病活動(dòng)性密切相關(guān)。腸道微生態(tài)紊亂會(huì)降低拮抗病原微生物的定植抵抗力，腸道免疫系統(tǒng)無(wú)法耐受這種菌群的變化，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損和腸道通透性改變，位于腸腔中的細(xì)菌和產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至腸黏膜固有層，黏膜免疫被激活，人體對(duì)自身腸腔中的細(xì)菌和產(chǎn)物失去耐受，進(jìn)而導(dǎo)致IBD的發(fā)生[12]。

IBD存在很多細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)異常的現(xiàn)象，包括T淋巴細(xì)胞亞群改變和黏膜IgG產(chǎn)生細(xì)胞，說(shuō)明黏膜免疫細(xì)胞在收到抗原刺激后聚集和被激活，尤其以輔助性T細(xì)胞激活顯著，進(jìn)而引起各種細(xì)胞因子分泌和釋放，使黏膜炎癥產(chǎn)生和加重，導(dǎo)致IBD相關(guān)的病理改變。血清中的IIRPCs是很多炎癥相關(guān)蛋白分子通過(guò)非共價(jià)鍵互相作用形成的一包含補(bǔ)體、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白、觸珠蛋白等的蛋白復(fù)合物，其與人體的補(bǔ)體、炎癥和免疫系統(tǒng)等密切相關(guān)。補(bǔ)體系統(tǒng)不僅能幫助機(jī)體發(fā)現(xiàn)和清除細(xì)菌，還有助于維持腸道免疫系統(tǒng)處于穩(wěn)定的狀態(tài)。有關(guān)兒童IBD的一項(xiàng)研究顯示，補(bǔ)體C4水平與患兒炎癥水平呈正相關(guān)，補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)微生物反應(yīng)程度的增強(qiáng)是導(dǎo)致IBD患者腸道微生態(tài)菌群失調(diào)的原因之一[13]。MPO是髓細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，存在于髓系細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是中性細(xì)胞衍生蛋白，當(dāng)機(jī)體受到感染、炎癥等刺激時(shí)，中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞就會(huì)釋放大量的MPO，MPO能將活化信號(hào)通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，使機(jī)體炎性反應(yīng)程度增強(qiáng)，并決定細(xì)胞浸潤(rùn)情況。MPO在很多感染性疾病的篩查、診斷、病情評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)中發(fā)揮著重要作用。此外，還有學(xué)者指出，MPO產(chǎn)生的自由基對(duì)小鼠腸道抗氧化能力、炎性反應(yīng)和腸道菌群結(jié)構(gòu)均會(huì)產(chǎn)生影響，其會(huì)通過(guò)不同作用參與到腸道菌群的調(diào)控中[14]。糞便中MPO的檢測(cè)對(duì)IBD的診斷具有較高的輔助臨床價(jià)值，其存在穩(wěn)定且易于檢測(cè)，能較好地反映患者腸道局部病變情況和疾病活動(dòng)性。有學(xué)者研究指出，血清MPO對(duì)IBD的輔助診斷也有一定的應(yīng)用價(jià)值，相比糞便標(biāo)本，血清標(biāo)本能更好地反映出患者全身的整體情況，但在特異性判斷疾病活動(dòng)性上可能有一定局限性[15]。CYP27B1是將循環(huán)形式維生素D轉(zhuǎn)化為有活性的1,25-OH2-D3過(guò)程的關(guān)鍵酶，也是維生素D的生物作用形式。研究指出，腸道炎性反應(yīng)組織中CYP27B1水平會(huì)顯著升高，其會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)循環(huán)中的維生素D水平來(lái)參與IBD的發(fā)生、發(fā)展[16]。腸道外周組織和免疫細(xì)胞(樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)中均可見(jiàn)CYP27B1的表達(dá)。CYP27B1對(duì)結(jié)腸黏膜有保護(hù)作用，其能通過(guò)維持局部組織的維生素D來(lái)參與機(jī)體的抗炎反應(yīng)。而維生素D已經(jīng)被證實(shí)能影響機(jī)體腸道屏障結(jié)構(gòu)、功能及微生物組成，從而影響腸黏膜和腸道菌群的穩(wěn)定性[17]。本研究結(jié)果顯示，UC、CD組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明顯高于健康對(duì)照組和疾病對(duì)照組，緩解期與活動(dòng)期，以及重度活動(dòng)期與輕度、中度活動(dòng)期患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，輕度活動(dòng)期患者與中度活動(dòng)期患者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相關(guān)性分析顯示，IBD患者的血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平與腸道腸球菌、腸桿菌、擬桿菌、酵母菌數(shù)量呈正相關(guān)(P<0.05)，與乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示與其他非IBD腸道疾病患者和健康人群比較，IBD患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明顯升高，其表達(dá)與患者疾病活動(dòng)性有關(guān)，而且與腸道菌群也存在一定相關(guān)性，血清IIRPCs、MPO、CYP27B1可作為無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物用于IBD患者與非IBD腸道疾病患者鑒別診斷及IBD患者病情活動(dòng)性的評(píng)估。但其在IBD發(fā)生、發(fā)展和患者腸道菌群紊亂中的具體作用和機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。