多重不對稱PCR-電化學(xué)芯片技術(shù)檢測感染性腹瀉病原體的臨床價值*

程 強，周 磊，付曉蕊，徐修禮，劉家云，郝曉柯

空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710032

腹瀉是指每日排便3次或3次以上，且糞便性狀異常，如稀便、水樣便、黏液便、膿血便或血便等[1]。感染性腹瀉是指由病原微生物及其產(chǎn)物或寄生蟲所引起的、以腹瀉為主要臨床特征的一組腸道傳染病[2]。感染性腹瀉居我國法定傳染病發(fā)病率首位，具有病原體種類復(fù)雜、混合發(fā)病率高、發(fā)病聚集性等特征，是重要的公共衛(wèi)生事件之一。在暴發(fā)流行時，對感染性腹瀉病原體進行快速診斷，對疫情的防控具有重要意義[3]。本研究以多重不對稱PCR-電化學(xué)芯片技術(shù)(簡稱電化學(xué)芯片法)檢測感染性腹瀉相關(guān)病原體，與FilmArray gastrointestinal panel法(簡稱FilmArray法)、普通細菌培養(yǎng)和病毒測序方法比較，計算檢測結(jié)果的陽性檢出率和一致性，探討電化學(xué)芯片法的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年10月至2019年6月本院兒科住院及門診病例標本，患兒以嘔吐或腹瀉等消化道癥狀為主訴，24 h內(nèi)腹瀉大便次數(shù)≥3次，糞便性狀異常的腹瀉患兒新鮮糞便標本。本研究采取患兒自愿原則，獲得患兒及家屬的知情同意。

1.2儀器與試劑 DA910電化學(xué)基因傳感器檢測系統(tǒng)、Smart 32全自動核酸提取儀購自中山大學(xué)達安基因股份有限公司；FilmArray全自動PCR分析系統(tǒng)購自法國生物梅里埃股份有限公司。核酸提取或純化試劑(磁珠法)、腹瀉病原體檢測試劑盒(電化學(xué)芯片法)購自中山大學(xué)達安基因股份有限公司；FilmArray gastrointestinal panel購自法國生物梅里埃公司。選擇性培養(yǎng)基(SS平板)；顯色培養(yǎng)基(弧菌顯色培養(yǎng)基、大腸顯色培養(yǎng)基)。沙門菌診斷用血清；副溶血弧菌診斷用血清。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3方法 取就診時腹瀉患兒新鮮糞便標本，立即放入Copan轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基中送檢。以普通細菌培養(yǎng)和病毒測序結(jié)果作為診斷的“金標準”。普通細菌培養(yǎng)：取新鮮待測標本立即接種于大腸顯色培養(yǎng)基、弧菌顯色培養(yǎng)基、沙門菌顯色培養(yǎng)基、TCBS平板、XLD平板、SS平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱孵育16～24 h，同時接種3%氯化鈉堿性蛋白胨水、改良亞硒酸鹽磺綠增菌肉湯增菌培養(yǎng)后，挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種至三糖鐵瓊脂等培養(yǎng)基，進一步進行腸道致病菌生化試驗、血清型分型試驗和藥敏試驗。結(jié)果依據(jù)每年美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)M100-S23標準進行判讀。病毒測序：待測標本采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序。電化學(xué)芯片法：使用Smart 32全自動核酸提取儀或純化試劑(磁珠法)進行待測標本的核酸提取、純化、擴增、雜交等，之后使用腹瀉病原體檢測試劑盒，針對17種常見的腹瀉相關(guān)病原體設(shè)計特異性引物和探針，探針包括捕獲探針和信號探針。捕獲探針分別固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成腹瀉電化學(xué)傳感器(芯片)，用于捕獲PCR多重擴增產(chǎn)物；信號探針與已捕獲的PCR產(chǎn)物特異結(jié)合。由于信號探針標記有二茂鐵分子，通過夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，應(yīng)用電化學(xué)基因傳感器檢測系統(tǒng)檢測出電流值(信號值)，最后對17種病原體檢測信息進行判定。試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對環(huán)境進行監(jiān)控； C-FX 陽性質(zhì)控品參與提取，用于 PCR 檢測試劑的質(zhì)控。FilmArray法：將待測標本根據(jù)規(guī)定條件加樣，使用FilmArray gastrointestinal panel和分析系統(tǒng)檢測。標準菌株：致瀉性大腸埃希菌、腸炎沙門菌、副溶血性弧菌、福氏志賀菌等均來自于本實驗室保存。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以率表示，電化學(xué)芯片法、FilmArray法與“金標準”方法結(jié)果比較，采用χ2檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。電化學(xué)芯片法、FilmArray法與“金標準”方法結(jié)果的一致性使用Kappa一致性檢驗進行分析，Kappa>0.4表示具有一致性。

2 結(jié) 果

2.1研究對象人群特征及不同方法病原檢出情況 隨機選取102例感染性腹瀉患兒，年齡1～15歲，男性54例，女性48例，以普通細菌培養(yǎng)和病毒測序結(jié)果作為“金標準”，使用3種不同方法對102例腹瀉標本進行腸道病原體檢測，結(jié)果見表1。“金標準”方法共82例標本呈陽性，陽性檢出率為80.39%，共檢出病毒102株，細菌18株。電化學(xué)芯片法檢測出78例標本呈陽性，陽性檢出率為76.47%，共檢出病毒81株，細菌15株。FilmArray法檢測出86例標本呈陽性，陽性檢出率為84.31%，共檢出病毒111株，細菌32株。3種方法同時檢出最多的腹瀉相關(guān)病原體為輪狀病毒A群。

表1 3種方法對102例感染性腹瀉標本病原體檢出情況

2.2電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標準”方法檢測結(jié)果比較 以“金標準”方法作為對照，分別與電化學(xué)芯片法和FilmArray法進行統(tǒng)計學(xué)比較。電化學(xué)芯片法與“金標準”方法比較，靈敏度為90.24%，特異度為80.00%，2種方法檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=44.092，P<0.05)。FilmArray法與“金標準”方法比較，靈敏度為97.56%，特異度為70.00%，2種方法檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=55.490，P<0.05)。見表2。

表2 電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標準”方法結(jié)果比較

2.3電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標準”方法一致性比較 以“金標準”方法作為對照，分別與電化學(xué)芯片法和FilmArray法進行一致性比較并進行Kappa檢驗。電化學(xué)芯片法與“金標準”方法比較，檢測結(jié)果完全和部分一致的標本有90例，不一致的標本有12例，一致率為88.24%，進行一致性檢驗，Kappa值為0.653，2種方法在統(tǒng)計學(xué)上具有較好的一致性。FilmArray法與“金標準”方法比較，檢測結(jié)果完全和部分一致的標本有94例，不一致的標本有8例，一致率為92.16%，進行一致性檢驗，Kappa值為0.731，2種方法在統(tǒng)計學(xué)上具有較好的一致性。見表3。

表3 電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標準”方法一致性比較

續(xù)表3 電化學(xué)芯片法和FilmArray法分別與“金標準”方法一致性比較

3 討 論

通過對本院兒科門診腹瀉患兒新鮮糞便標本進行檢測，“金標準”方法的陽性檢出率為80.39%，感染性腹瀉以輪狀病毒感染為主，且混合感染發(fā)病率高，與張輝等[4]調(diào)查研究基本一致。“金標準”方法發(fā)現(xiàn)20例諾如病毒感染患兒，占比較高，應(yīng)引起注意。諾如病毒感染后，極易在同齡兒童聚集地，如學(xué)校引起暴發(fā)流行[5-6]。細菌性病原體以致病性大腸埃希菌為主，未發(fā)現(xiàn)沙門菌，與以往報道有差別[7]，可能與采集標本時間、地點、標本量有關(guān)。未發(fā)現(xiàn)志賀菌和霍亂弧菌等引起法定傳染病的致病菌，且在實際工作中發(fā)現(xiàn)，采用普通細菌培養(yǎng)方法診斷感染性腹瀉致病菌的陽性檢出率低于FilmArray法[8-9]。在感染性腹瀉的診斷中，分子診斷技術(shù)是對傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法的良好補充。

在檢測腹瀉患兒標本中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用FilmArray法檢測準確率高，與國外報道一致，標本周轉(zhuǎn)時間2.0 h左右，耗時短，僅需一步手工加樣，操作簡單[10-11]，但此方法每臺儀器只能檢測1例患兒標本，通量嚴重不足，單標本檢測費用較高[12]，患兒家庭負擔較重，目前在國內(nèi)不適合開展大規(guī)模診斷。電化學(xué)芯片法與“金標準”方法結(jié)果比較，靈敏度為90.24%，特異度為80.00%，一致率為88.24%，檢測結(jié)果整體情況較好。電化學(xué)芯片法發(fā)現(xiàn)多重感染性腹瀉病原體能力不如FilmArray法[13-14]，標本周轉(zhuǎn)時間約為5.5 h，多于FilmArray法，但是少于實時熒光定量PCR方法[15]，可同時檢測32例患兒標本，通量高，手工操作步驟少，在一定程度上降低人為操作誤差，人員經(jīng)簡單培訓(xùn)，即可進行檢測，便于開展，且標本檢測成本較FilmArray法大幅降低。

電化學(xué)芯片法檢測結(jié)果與其他方法比較時，也發(fā)現(xiàn)了一些問題。(1)整體陽性檢出率為76.47%，還需要進一步提高；(2)檢測結(jié)果的準確率還需要進一步提高；(3)在混合感染中，該方法的鑒別能力不足，應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化試劑成分，以達到更好的效果。

總之，多重不對稱PCR-電化學(xué)芯片技術(shù)，系統(tǒng)靈敏度、特異度較好，具有良好的臨床應(yīng)用價值。