miR-212在老年前列腺癌患者中的表達及其對癌細胞增殖、侵襲、轉移的影響機制研究*

鄭 博，劉 欣，鄔宇龍，陳進渠，許麗明△

1.廈門市第五醫院泌尿外科，福建廈門 361000；2.廈門醫學院附屬第二醫院放射影像科，福建廈門 361000

前列腺癌是男性最常見的高異質性腫瘤，隨著腫瘤細胞的增殖和浸潤易發生骨轉移。據報道，約70%前列腺癌患者可發生骨轉移[1]。該病的高異質性給臨床治療帶來巨大挑戰，對患者短期生存率有較大影響。學者根據其異質性確定了前列腺癌患者不同基因組變化及其介導的不同信號通路，許多因子在上皮-間質轉化(EMT)過程中發現其表達、分布及功能的改變，多為轉化生長因子β(TGF-β)、Snail、catenin、基質金屬蛋白酶(MMP)等[2-3]。最新研究顯示，EMT通路參與細胞增殖、侵襲、轉移等多種細胞行為學過程[4]，且前列癌細胞不表達Snail、catenin等情況下仍能發生EMT，提示在前列腺癌復雜的生物學行為中可能存在其他更為特異性的調控機制。微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼單鏈的高度保守RNA，為轉錄后調控因子，其與多種惡性腫瘤發生和發展的關系已有較多報道[5-6]。miR-212是近年發現的miRNA家族中的一個重要分子，具有較強特異度和靈敏度，考慮可能通過介導EMT信號通路參與前列腺癌生物學行為。本文主要探討miR-212在老年前列腺癌患者中的表達及其對癌細胞增殖、侵襲、轉移的影響機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本、細胞株 經病理檔案室收集2017年10月至2019年10月于廈門市第五醫院行手術確診的前列腺癌患者60例的癌組織標本及配對癌旁正常組織標本為材料，術中組織液氨冷凍后放入-80 ℃保存；24株人前列腺癌PC-3細胞購自上海北諾生物科技有限公司，研究獲得廈門市第五醫院醫學倫理會批準，實驗符合癌細胞處理和使用相關規定。

1.1.2重組慢病毒轉染細胞 接種對數生長期的PC-3細胞，加DMEM培養液(上海輔澤商貿有限公司；含10%胎牛血清，購自鄭州九龍生物制品)，置于WJ-3-160T型CO2培養箱(上海新諾儀器設備有限公司)中培養；待細胞融合度達到70%～80%，換無血清的培養基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000轉染說明書(上海恒斐生物科技有限公司)進行轉染；將24株人前列腺癌PC-3細胞分為空白組(不作任何處理)、對照組(轉染空白miR-212對照)、miR-212組(轉染miR-212 mimics)，每組各8株，轉染72 h后觀察轉染效果。

1.2方法

1.2.1miR-212相對表達水平檢測 PBS(Solarbio)沖洗癌細胞和癌旁正常細胞，RIPA蛋白裂解液(北京普利萊基因有限公司)裂解后取上清液，BCA試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)測定蛋白質水平；依次上樣、電泳、轉膜、封閉、漂洗，加miR-212一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4 ℃冰箱過夜；漂洗后加二抗，25 ℃搖床1 h；漂洗后用ECL發光試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司)曝光、顯影。

1.2.2細胞增殖率檢測 接種對數生長期PC-3細胞制成單細胞懸液，細胞貼壁后加10 μL CCK-8溶液，培養180 min；BIOBASE-EL10B酶標儀測定吸光度(A)值，細胞增殖率(%)= (A研究組細胞/A空白組細胞)×100%。計算轉染后12、24、36、48 h的細胞增殖率。

1.2.3細胞侵襲能力檢測 Transwell小室上室中加5×108/L的PC-3細胞和60 μL基質膠，下室中加600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養液，培養24 h；取下室液體，4%多聚甲醛溶液(南京森貝伽生物科技有限公司)固定15 min，HE染色試劑盒染色30 min，觀察并計算穿過小室膜的平均細胞數，以此表示細胞侵襲能力。

1.2.4細胞轉移率檢測 PC-3細胞中加0.25%胰蛋白酶(廣州達暉生物技術股份有限公司)調整細胞濃度至2×108/L，接種并待細胞融合度達80%后，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕；PBS緩沖液洗滌3次，加入無血清培養基，培養24 h，觀察細胞遷移軌跡。

1.2.5雙熒光素酶報告實驗 參照生物信息預測網站預測miR-212和EMT結合片段，將擴增的EMT3′-UTR序列插入到含有miR-212質粒的位點中，構建EMT3′-UTR熒光素酶報告載體EMT-WT (野生型)及突變載體EMT-MUT(突變型)；與空白組、對照組、miR-212組共轉染至PC-3細胞，Dual-Luciferase報告基因試劑盒檢測細胞熒光活性，分析miR-212與EMT結合的關系。

2 結 果

2.1前列腺癌組織和癌旁正常組織miR-212表達情況比較 miR-212在前列腺癌組織中呈低表達，在癌旁正常組織中呈高表達，見圖1。前列腺癌組織和癌旁正常組織中miR-212的相對表達水平分別為1.78±0.25、3.38±0.41，前列腺癌組織中miR-212的相對表達水平低于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 前列腺癌組織和癌旁正常組織中miR-212表達圖(Western blot法)

2.2空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞增殖率比較 轉染miR-212后，PC-3細胞增殖受到抑制；24、36、48 h時，miR-212組PC-3細胞增殖率低于對照組、空白組(P<0.05)，空白組和對照組PC-3細胞增殖率比較差異無統計意義(P>0.05)。見表1。

表1 空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞在不同時間的增殖率比較

2.3空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞侵襲能力比較 空白組、對照組PC-3細胞向器官表面靠攏，基底層可見較多偽足，形成的癌巢較大；miR-212組PC-3細胞較少，不見偽足或僅有少量偽足，未形成癌巢，見圖2。轉染miR-212后，PC-3細胞侵襲能力受到抑制；miR-212組PC-3細胞侵襲能力低于對照組、空白組(P<0.05)；空白組和對照組PC-3細胞侵襲能力比較，差異無統計意義(P>0.05)。見圖3。

注：A表示空白組，B表示對照組，C表示miR-212組。

注：與空白組比較，aP<0.05;與對照組比較，bP<0.05。

2.4空白組、對照組和miR-212組PC-3細胞轉移率比較 空白組、miR-212組PC-3細胞在劃痕48 h后逐漸愈合，劃痕變小，miR-212組PC-3細胞在劃痕48 h后未發生愈合，劃痕甚至變大，見圖4。轉染miR-212后，PC-3細胞轉移能力受到抑制；miR-212組PC-3細胞轉移率低于對照組、空白組(P<0.05)；空白組和對照組PC-3細胞轉移率比較，差異無統計意義(P>0.05)，見圖5。

2.5miR-212和EMT轉染后熒光素酶活性分析 miR-212與EMT-WT共轉染后細胞熒光活性顯著低于對照組與EMT-WT共轉染后細胞熒光活性(P<0.05);空白組與對照組比較，與EMT-WT共轉染后細胞熒光活性差異無統計意義(P>0.05)。空白組、對照組、miR-212組與EMT-MUT共轉染后細胞熒光活性差異無統計意義(P>0.05)。見圖6。

注：A表示空白組，B表示對照組，C表示miR-212組。

注：與空白組比較，aP<0.05;與對照組比較，bP<0.05。

注：與空白組比較，aP<0.05;與對照組比較，bP<0.05。

3 討 論

前列腺癌發生骨轉移后可表現為骨骼疼痛、病理性骨折、癱瘓、行為能力降低、骨髓抑制性貧血等，直接影響患者預后和生存質量。隨著分子治療的深入研究，目前關于前列腺癌生物學行為、細胞基礎、相關細胞因子及其與關鍵的細胞信號轉導通路的報道較多，最新研究認為，EMT是促進前列腺癌增殖和轉移的關鍵性因素[7-8]。且EMT過程中多種細胞因子發揮重要作用，筆者認為篩選出其中特異性因子可為前列腺癌的防治提供新的治療靶點。miR-212自發現以來已被證實可參與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程。DING等[9]研究顯示，miR-212在胰腺癌組織中低表達，且低表達miR-212組侵襲能力更高。李耀輝等[10]研究指出，高表達miR-212可促進膀胱癌細胞增殖、轉移、侵襲過程。SHA等[11]的體外實驗結果顯示，miR-212在肝癌細胞中低表達，可調節腫瘤細胞與腫瘤微環境的相互作用。miR-212在前列腺癌中低表達，上調miR-212表達可抑制癌細胞血管浸潤和淋巴結轉移，且預示著該病預后較好[12]。本文前列腺癌組織中miR-212呈低表達，與上述研究一致。本文采用CCK-8法檢測不同時間對前列腺癌PC-3細胞增殖的影響，結果顯示出，過表達miR-212可有效抑制癌細胞生長增殖，提示miR-212在參與前列腺癌病理性進展中發揮抑癌作用。根據轉染時間圖發現，過表達miR-212對前列腺癌細胞作用機制呈時間依賴性，時間越長，抑制效果越明顯。湯利等[13]的平板克隆實驗結果顯示，轉染miR-212細胞可明顯降低單細胞克隆形成率，達到有效抑制膀胱癌細胞增殖的作用。本文Transwell小室實驗結果表明，轉染組穿過小室膜的細胞數更低，細胞轉移率也更低，表明miR-212可有效降低前列腺癌細胞侵襲、轉移能力，證實miR-212是一種可在體內外調節腫瘤細胞侵襲和轉移的調控因子。SHKURNIKOV等[14]研究發現，miR-212能擴大其他眾多癌基因轉錄，其主要通過靶向調節特異性信號蛋白通路來抑制前列腺癌的侵襲能力。本文通過雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-212組與EMT-WT共轉染后的細胞熒光活性顯著低于對照組與EMT-WT共轉染后的細胞熒光活性，結合國內外研究結果[15-16]，提示miR-212可通過靶向調節EMT信號通路影響前列腺癌細胞的增殖、轉移、侵襲能力。

miR-212在前列腺癌組織中呈低表達，過表達miR-212可通過靶向調節EMT信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲、轉移能力，有望成為前列腺癌的一種新的生物治療靶點。但由于時間限制，樣本量小，且前列腺癌進展受多種因素影響，仍需設計更為嚴密的、多中心、大樣本、雙盲研究進一步分析相關生物學行為機制。