86株鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶耐藥基因分析及同源性研究*

劉建華，李 銳，錢樹坤，高 媛

首都醫科大學附屬北京康復醫院檢驗科，北京 100144

鮑曼不動桿菌是非發酵需氧革蘭陰性桿菌，分布廣泛，是引起院內感染的重要病原菌之一，尤其對于老年患者、接受侵入性醫療操作患者及使用廣譜抗菌藥物治療患者，可引起呼吸道、泌尿道、血液、傷口等感染[1-4]。隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的廣泛應用，近年來鮑曼不動桿菌對其耐藥率不斷上升，在院內甚至地區間存在播散，為醫院感染防控帶來挑戰。本研究收集北京康復醫院住院患者臨床分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌86株，采用基因組重測序技術對其所攜帶的耐藥基因及同源性進行分析，為鮑曼不動桿菌的治療及防控提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 選取2017年12月至2018年12月北京康復醫院住院患者臨床感染病例中分離到的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌86株，剔除同一患者因長期住院分離的重復菌株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。86例患者年齡18～104歲；男66例(76.7%)，女20例(23.3%)；>60歲者56例，占65.1%。

1.2儀器與試劑 Bact/ALERT 3D全自動血培養儀及配套血培養瓶，BD Phoenix 100全自動微生物鑒定儀。血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。菌種保存管購自天津金章科技發展有限公司。細菌基因組重測序委托杭州聯川生物技術股份有限公司完成。

1.3方法

1.3.1細菌分離培養與藥敏鑒定試驗 嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》第4版[5]進行標本采集和培養，采用BD Phoenix 100全自動微生物鑒定儀進行菌株鑒定和藥敏試驗，依據CLSI M100文件進行藥敏結果判定。使用菌種保存管收集菌株，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2耐藥基因及同源性檢測 委托杭州聯川生物技術股份有限公司進行耐藥基因及同源性檢測。采用基因組重測序技術檢測其攜帶的耐藥相關基因并進行進化樹分析。多位點序列分型分析菌株間的同源性。同時，進行eBURST比對分析。

1.4統計學處理 應用WHONET5.6統計軟件對所有數據進行分析處理。計數資料采用例數和率進行統計描述。

2 結 果

2.1菌株來源分析 86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌標本來源主要以痰液標本為主(66株，76.7%)，其次為尿液標本(18株，20.9%)，分泌物和腦脊液標本各1株，分別占1.16%。86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌主要來自神經康復中心(33株，38.4%)、老年康復中心(27株，31.4%)、心臟康復中心(13株，15.1%)，其余科室檢出較少。

2.2藥敏試驗結果分析 86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌均表現為多重耐藥。對亞胺培南和美羅培南全部耐藥；對頭孢菌素類、氟喹諾酮類、哌拉西林及哌拉西林/他唑巴坦、四環素等藥物耐藥率均在95%以上；氨基糖苷類抗菌藥物中，對阿米卡星耐藥率為79.1%，較慶大霉素(86.0%)稍低；對復方磺胺甲噁唑耐藥率為75.6%；對多黏菌素B均表現為敏感。見表1。

表1 耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌抗菌藥物藥敏試驗結果[n(%)]

2.3耐藥基因檢測結果分析 利用基因組重測序技術對86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌進行耐藥相關基因檢測，共檢出38種耐藥基因，包括β內酰胺酶基因、碳青霉烯酶基因及多種外排泵相關基因、抗菌藥物修飾酶等。全部菌株均攜帶OXA-23型碳青霉烯酶耐藥基因；OXA-66型72株，占83.7%；OXA-51型僅2株，占2.3%。其次，檢出ADC型AmpC β內酰胺酶基因83株，占96.5%；TEM-1型58株，占67.4%。檢出外排泵相關基因及抗菌藥物修飾酶基因等，其中最多的是氨基糖苷類相關耐藥基因armA(71株)、APH(6)-Ⅰd(67株)、APH(3″)-Ⅰb(67株)、aac(6′)-Ⅰb(31株)、ant(3″)-Ⅰa (28株)、aac(3′)-Ⅰa(13株)，大環內酯類耐藥基因msrE (69株)、mphE(67株)，四環素耐藥基因tet(B)(67株)、APH (3′)-Ⅰa(54株)，磺胺類抗菌藥物耐藥基因sul1(32株)、sul2(20株)，氯霉素耐藥基因catB8(31株)等。

2.4多位點序列分型結果 86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌共檢出15種ST型，其中ST208有31株，占36.0%；ST195有12株，占14.0%；ST540有8株，占9.3%；ST191有5株，占5.8%。其余ST型菌株數較少。

2.5同源性分析 86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌中某些菌株之間的親緣關系較近，如進化樹圖1中Ⅰ和Ⅱ包含的菌株。并且進一步通過與數據庫中已有鮑曼不動桿菌序列型進行eBURST比對分析，得到1個同分型組和7個單體組，同一分型組的菌株間具有較近的親緣關系，見圖2。

注：自上至下菌株順序為Aba29、Aba65、Aba64、Aba46、Aba80、Aba45、Aba12、Aba11、Aba63、Aba73、Aba14、Aba19、Aba53、Aba33、Aba86、Aba75、Aba44、Aba02、Aba08、Aba42、Aba35、Aba83、Aba37、Aba17、Aba31、Aba57、Aba30、Aba47、Aba59、Aba76、Aba01、Aba10、Aba39、Aba23、Aba26、Aba71、Aba36、Aba15、Aba18、Aba25、Aba13、Aba40、Aba79、Aba69、Aba74、Aba43、Aba58、Aba21、Aba06、Aba51、Aba70、Aba55、Aba66、Aba34、Aba05、Aba56、Aba67、Aba38、Aba04、Aba60、Aba32、Aba61、Aba03、Aba49、Aba52、Aba48、Aba28、Aba22、Aba68、Aba27、Aba85、Aba77、Aba62、Aba82、Aba50、Aba81、Aba07、Aba16、Aba78、Aba54、Aba20、Aba72、Aba09、Aba24、Aba84、Aba41。

注：數字越大代表菌株數量越多。

3 討 論

鮑曼不動桿菌是醫院感染的重要病原菌，可引起全身各部位的感染。近年來隨著碳青霉烯類抗菌藥物廣泛應用于臨床各類治療中，臨床分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌越來越多，患者病死率增加，碳青霉烯類抗菌藥物作為針對革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”，其臨床應用前景面臨嚴峻挑戰[6-7]。

本研究收集了北京康復醫院2017年12月至2018年12月住院患者臨床感染病例中分離到的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌共86株，其中56株分離自老年患者(>60歲)，占65.1%。而且標本來源以痰液標本和尿液標本為主，分別占76.7%和20.9%，分布前3位的科室是神經康復中心(38.4%)、老年康復中心(31.4%)、心臟康復中心(15.1%)。這與本院作為康復醫院收治患者的特點密切相關，住院患者大部分是老年人，尤其上述3個科室，患者大多長期住院，自身基礎性疾病較多，免疫力低下，大多發生過心腦血管事件，導致需要進行侵入性治療，長期氣管切開或氣管插管，留置導尿管，以及廣譜抗菌藥物的大量使用，容易成為耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的易感對象。同時，由于該菌特殊的生物學特點，容易定植，可以在醫院環境中廣泛存在并且長期存活，使得其容易在老年患者中暴發流行。

通過對86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的藥敏結果進行分析，發現其耐藥情況非常嚴重，對臨床常用抗菌藥物的耐藥性普遍較高。除了對多黏菌素B均敏感外，僅有21株(24.4%)對復方磺胺甲噁唑敏感，17株(19.8%)對阿米卡星敏感，12株(14.0%)對慶大霉素敏感，對其他抗菌藥物的敏感率均在5.0%以下。因此，應當高度重視老年患者發生耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染，合理使用抗菌藥物。

鮑曼不動桿菌的耐藥機制復雜多樣，其中主要的耐藥機制包括產各種β內酰胺酶，外排泵的過度表達，對藥物作用靶點進行修飾，膜通透性下降，產生生物被膜等[8]。本研究結果顯示,86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌均攜帶OXA-23型碳青霉烯酶基因，OXA-66型基因檢出率為83.7%，OXA-51型基因檢出率為2.3%。提示OXA-23型碳青霉烯酶基因為本院臨床分離耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌主要攜帶的基因型，是引起鮑曼不動桿菌對碳青霉烯酶類抗菌藥物耐藥的主要原因之一，與國內相關報道一致[6-7,9-10]。另外，AmpC型β內酰胺酶基因檢出率為96.5%，TEM-1基因檢出率為67.4%，提示產生β內酰胺酶是導致86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌對碳青霉烯酶類及頭孢菌素類抗菌藥物耐藥率>95.0%的原因之一。

外排泵的過度表達及抗菌藥物修飾酶等也是鮑曼不動桿菌產生多重耐藥的重要機制[11-12]。本研究結果顯示，86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌攜帶氨基糖苷類相關耐藥基因armA(71株)、APH(6)-Ⅰd(67株)、APH (3″)-Ⅰb(67株)、aac(6′)-Ⅰb(31株)、ant(3″)-Ⅰa (28株)、aac(3′)-Ⅰa(13株)，大環內酯類耐藥基因msrE(69株)、mphE(67株)，四環素耐藥基因tet(B)(67株)、APH(3′)-Ⅰa(54株)，磺胺類抗菌藥物耐藥基因sul1(32株)和sul2(20株)，氯霉素耐藥基因catB8(31株)。以上多種耐藥基因的表達可以導致鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類、磺胺類、大環內酯類、四環素類等抗菌藥物產生耐藥。

本研究應用多位點序列分型技術對86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌進行分析，發現15種ST型，其中ST208占36.0%,ST195占14.0%,ST540占9.3%,ST191占5.8%,其余ST型菌株數較少。經過eBURST比對分析得到一個同分型組和7個單體組，ST208、ST195、ST540、ST191、ST369、ST469、ST218為同一分型組，各菌株之間存在同源相關性，提示本院耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌存在一定流行趨勢，醫院感染防控部門及臨床科室應密切關注醫院內部耐藥菌的傳播流行。

綜上所述，北京康復醫院2017年12月至2018年12月分離到的86株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物普遍耐藥，給臨床治療帶來巨大挑戰。其中OXA-23型碳青霉烯酶是引起北京康復醫院鮑曼不動桿菌對碳青霉烯酶類抗菌藥物耐藥的重要原因，其他多種β內酰胺酶基因及外排泵基因的表達導致其多重耐藥情況嚴重。并且，北京康復醫院檢出菌株間存在一定的同源相關性。加之北京康復醫院收治患者的臨床特點，因此，應加強醫院感染防控工作，加強各種醫療器械及用品的消毒管理，提高醫務人員手衛生意識，嚴格執行無菌操作及消毒隔離，防止耐藥菌在患者間的傳播，避免院內感染暴發[12]。同時，應根據藥敏結果合理使用抗菌藥物，延緩耐藥菌的產生。