肺炎支原體肺炎患兒血漿miR-223、miR-21水平變化及其與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的關系研究*

梁 淳，尹 蕾，田 偉

河北省邯鄲市中心醫院檢驗科，河北邯鄲 056008

肺炎支原體肺炎(MPP)是兒童臨床上常見的獲得性肺炎之一，潛伏期較長[1-2]。因MPP發病早期隱匿，且復發率高，久治不愈，如未及時治療，易威脅患兒生命[3]。微小RNA(miRNA)是新發現的一類非編碼RNA，在不同疾病人群中，血漿miRNA表達存在明顯差異[4]。有研究顯示，T淋巴細胞可激活機體免疫系統維持免疫功能平衡，而炎癥因子可激活炎性反應，兩者均可能參與了MPP的發生、發展[5]。與血清檢測比較，血漿標本檢查前放置的時間相對較短，可有效避免外界因素對檢測結果造成的干擾，并節約檢測時間。本文主要研究MPP患兒血漿miR-223、miR-21水平變化及其與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2017年2月至2019年2月收治的MPP患兒120例作為觀察組，其中男67例，女53例；年齡5～14歲，平均(10.80±2.55)歲。納入標準：(1)所有MPP患兒均與《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(2015版)》[6]中所制訂的MPP相關診斷標準相符；(2)無哮喘、心肌炎及心包炎等其他相關炎癥疾病；(3)入院前尚未接受相關治療。排除標準：(1)伴有其他常見呼吸系統疾病；(2)存在免疫缺陷；(3)臨床病歷資料缺失。另取同期于本院進行體檢的健康兒童120例作為對照組，其中男69例，女51例；年齡5～15歲，平均(10.84±2.58)歲。2組兒童年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有受試者家屬均在知情同意書上簽字，本研究獲得醫院倫理委員會審批通過。

1.2研究方法 (1)采用實時熒光定量PCR法檢測血漿miR-223、miR-21水平。首先采用血漿總RNA提取試劑盒(購自德國Qiagen公司)進行血漿總RNA的提取，并進行純化。紫外分光光度計測定260 nm的吸光度(A)值,計算RNA濃度，控制其處于0.15～1.00。隨后進行反轉錄，嚴格按照miScriptⅡ反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。總反應體系為20 μL，反應條件為37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min。采用無酶水稀釋后保存于-20 ℃冰箱中備用。由德國Qiagen公司設計合成相關引物，根據miScript SYBR Green Kit說明書完成反應混合物的配制，每個反應體系為15 μL，采用羅氏LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀檢測，反應條件如下：95 ℃預激活15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共45個循環。每個反應孔均設置3個復孔，以內參實現歸一化。miR-223上游引物：5′-CAG AAA GCC CAA TTC CAT CT-3′；下游引物：5′-GGG CAA ATG GAT ACC ATA CC-3′。miR-21上游引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGT AGC TTA TCA GAC TGA-3′；下游引物：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GT-3′。待測miRNA水平采用相對定量軟件Ver1.0根據2-ΔΔCt法計算獲得。(2)以流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞亞群水平。分別取2組兒童的外周血標本100 μL，加入試劑混勻后放置在避光室溫條件下進行時長為30 min的孵育，隨后加入紅細胞裂解液進行紅細胞的裂解，以PBS清洗，控制細胞濃度為1×106個/mL，采用流式細胞儀收集細胞，并完成CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞的檢測及CD4+/CD8+的計算。(3)采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清白細胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，分別于入院后第2天清晨采集觀察組兒童空腹狀態下及對照組兒童體檢時靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心20 min，取上清液，置于冰箱中保存備用，操作嚴格遵從相關試劑盒說明書完成，試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司。

2 結 果

2.12組兒童血漿miR-223、miR-21水平比較 觀察組兒童血漿miR-223、miR-21水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組兒童血漿miR-223、miR-21水平比較

2.22組兒童外周血T淋巴細胞亞群水平比較 觀察組兒童外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+水平均顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。2組兒童外周血T淋巴細胞的檢測結果見圖1。

表2 2組患兒外周血T淋巴細胞亞群水平比較

2.32組兒童血清炎癥因子水平比較 觀察組兒童血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組兒童血清炎癥因子水平比較

2.4觀察組患兒血漿miR-223、miR-21水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，觀察組患兒血漿miR-223、miR-21水平與外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+水平呈負相關(P<0.05)；而與血清IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相關(P<0.05)。見表4。

圖1 2組兒童外周血T淋巴細胞的檢測結果

表4 觀察組患兒血漿miR-223、miR-21水平與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的相關性分析

3 討 論

MPP是一種多發生于5～15歲兒童肺炎支原體(MP)感染的流行病，若不進行及時、有效的干預，隨著病情的不斷進展可能引發患兒免疫功能紊亂，同時可能導致心、肝、腎、腦等多器官損傷，對患兒的生命健康安全造成極大威脅[7-9]。隨著近年來相關研究的不斷深入，越來越多的研究報道證實體液免疫及細胞免疫中的大量炎癥因子均介導了MP的發病過程[10-12]。患兒因自身免疫系統發育尚未完善，炎癥因子在MP感染過程中的免疫機制、炎性反應發生機制仍存在一定的爭議，需進一步研究探討。miRNA是一種可有效調節真核細胞基因表達的單鏈小片段RNA，具有調控炎癥因子及介質表達的作用[13-14]。miR-223、miR-21是近年來所發現的新型miRNA，可通過對下游IL-6、IL-10等炎癥因子的表達產生影響，進一步促進相關疾病的發生、發展。相關研究報道顯示，miR-223在食管癌患者外周血中表達顯著上調[15]，而miR-21在肺癌患者外周血中表達明顯上調[16]，因此，筆者推測兩者可能參與了惡性腫瘤的發生、發展過程。本文通過研究MPP患兒血漿miR-223、miR-21水平變化及其與T淋巴細胞亞群、炎癥因子的關系，旨在為MPP患兒的診治提供新的思路和靶點。

本研究結果顯示，觀察組兒童血漿miR-223、miR-21水平顯著高于對照組，提示隨著血漿miR-223、miR-21水平的不斷升高，MPP發生風險隨之升高。分析原因，筆者認為miR-223、miR-21均與炎癥密切相關，可能通過與多種抗炎因子靶基因相結合，繼而對相關靶基因的表達產生抑制，發揮生物學功能，促進MPP的發展[17-18]。此外，觀察組兒童外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+水平顯著低于對照組，這與張曉峰等[19]的研究報道相符。其中CD3+T淋巴細胞在一定情況下可反映機體T淋巴細胞活化情況，進而反映機體免疫狀況，其水平降低說明T淋巴細胞活化受到抑制；CD4+T淋巴細胞則可刺激T淋巴細胞轉化為效應細胞或活化巨噬細胞，進而發揮免疫作用，其水平的降低間接反映免疫功能受到抑制；CD8+T淋巴細胞具有滅殺感染靶細胞的作用，其水平的降低表明機體滅殺感染細胞的能力降低；CD4+/CD8+降低反映機體免疫力的下降。筆者推測，MPP患兒外周血中免疫系統可能出現一定程度的紊亂。另外，觀察組兒童血清IL-6、IL-8、TNF-α水平顯著高于對照組，其主要原因為當患兒的肺部發生感染或感染加重時，肺內的局部炎癥因子會出現“瀑布式”鏈式反應，繼而促進大量炎癥因子、巨噬細胞的快速浸潤和擴散[20]。肺泡上皮細胞及肺血管內皮細胞受損后，中性粒細胞與炎癥因子會快速進入肺泡腔，繼而促進炎性反應的加劇，進一步增加上述各項血清炎癥因子的釋放。Pearson相關分析結果顯示，觀察組患兒血漿miR-223、miR-21水平與外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+水平呈負相關，而與血清IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相關，這充分說明血漿miR-223、miR-21介導MPP發生、發展的主要機制可能和調節T淋巴細胞亞群及炎癥因子水平密切相關。

綜上所述，MPP患兒血漿miR-223、miR-21水平明顯較健康兒童升高，且二者與T淋巴細胞亞群和炎癥因子有關，初步證實miR-223、miR-21具有成為MPP防治新靶點的潛力。