一株采油枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化

王慧冬，修建龍，黃立信，俞理，馬原棟

(1.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；2.中國(guó)科學(xué)院滲流流體力學(xué)研究所，河北 廊坊 065007； 3.中國(guó)石油勘探開(kāi)發(fā)研究院，北京 100083)

油藏經(jīng)過(guò)一次采油和二次采油后，只能收集40%左右[1]。因此3次采油技術(shù)備受關(guān)注[2]。常見(jiàn)三采方法有：熱力驅(qū)、化學(xué)驅(qū)、混相驅(qū)和微生物強(qiáng)化采油[3]，其中微生物采油越來(lái)越受到重視。枯草芽孢桿菌是一種微生物驅(qū)油中常用的菌種[4]，發(fā)酵時(shí)可以產(chǎn)生大量脂肽類生物表面活性劑[5-6]，具有獨(dú)特的兩親性分子結(jié)構(gòu)，可以在油水兩相界面定向排列，形成分子層，降低表面張力、改變巖石表面的潤(rùn)濕性、與原油形成乳狀液，有利于提高原油采收率[7-9]，油田現(xiàn)場(chǎng)油藏注氣困難且氣體利用率低，導(dǎo)致好氧菌種生長(zhǎng)緩慢，因此內(nèi)源發(fā)酵效果較差，而地面增殖發(fā)酵后,將發(fā)酵液直接注入油井是一個(gè)很好的解決方法[10]，但是發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)劑用量大，發(fā)酵成本高。本文通過(guò)培養(yǎng)基中NH4Cl部分代替NaNO3，既降低了成本，同時(shí)可以保證脂肽產(chǎn)量，在微生物驅(qū)油工藝中有很好的應(yīng)用潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

供試菌株BacillussubtilisSL-2，為中科院滲流流體力學(xué)研究所三次采油重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微生物滲流實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)所保存菌種;蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油、玉米漿干粉、酵母粉、豆粕粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl、KH2PO4、12H2O·Na2HPO4、7H2O·MgSO4、蘇丹染液均為分析純。

梅特勒 FE28-standard pH測(cè)定儀；FTA1000B表面張力測(cè)試儀。

1.2 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基為液體LB(Luria-Bertani培養(yǎng)基)，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))：NaCl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30 g/L，NaNO33 g/L,KH2PO42.5 g/L，12H2O·Na2HPO430 g/L，7H2O·MgSO40.8 g/L。

1.3 菌種活化及種子液制備

將菌種庫(kù)冷凍甘油管中菌種接入裝有 150 mL LB 液體種子培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，37 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)14 h，進(jìn)行活化。取上述活化后的菌液，以同樣的方式培養(yǎng)14 h，用作種子液。

1.4 搖瓶發(fā)酵

取種子液，以5%(V/V)接種量接入盛有150 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，置于搖床中，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為 180 r/min，振蕩培養(yǎng)120 h，發(fā)酵完成后取發(fā)酵液測(cè)試排油圈與表面張力。

1.5 測(cè)試方法

脂肽產(chǎn)量用排油圈法[11]進(jìn)行檢測(cè)，其可靠性較高[12]。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)脂肽樣品，可得排油圈直徑與產(chǎn)量線性關(guān)系，并獲得線性方程：y=(D-1.107)/0.009×n(其中D為排油圈直徑，n為發(fā)酵液稀釋倍數(shù))。

表面張力使用表面張力測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)基的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 碳源的優(yōu)化 選取5種常規(guī)碳源,蔗糖、葡萄糖、糖蜜、甘油、玉米漿干粉，用量均為30 g/L。初始培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 30，NaNO33，KH2PO42.5，12H2O·Na2HPO430。在初始pH為7.5的條件下，進(jìn)行SL-2的發(fā)酵，然后取樣測(cè)定其排油圈直徑，通過(guò)公式計(jì)算脂肽產(chǎn)量，最后測(cè)定表面張力，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。其中CK為空白對(duì)照。

圖1 碳源對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source on lipopeptide yield

圖2 碳源對(duì)表面張力的影響Fig.2 Influence of carbon source on surface tension

由圖1可知，以蔗糖為碳源時(shí)，脂肽產(chǎn)量最高，達(dá)到2.39 g/L，且以糖類為碳源時(shí)，72 h后仍會(huì)繼續(xù)發(fā)酵，而甘油和玉米漿干粉為碳源，則在72 h后停止發(fā)酵。由圖 2可知,以蔗糖為碳源，發(fā)酵液表面張力從初始的67.2 mN/m降至25.1 mN/m，是5種碳源中表面張力降低幅度最大的。

2.1.1.2 氮源的優(yōu)化 選取5種常規(guī)氮源酵母粉、豆粕粉、蛋白胨、硝酸鈉和氯化銨，用量均為3 g/L。初始培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 30，NaNO33，KH2PO42.5，12H2O·Na2HPO430。在初始pH為7.5的條件下，進(jìn)行SL-2的發(fā)酵，然后取樣測(cè)定其排油圈直徑，通過(guò)公式計(jì)算脂肽產(chǎn)量，最后測(cè)定表面張力，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 氮源對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on lipopeptide yield

圖4 氮源對(duì)表面張力的影響Fig.4 Influence of nitrogen source on surface tension

由圖3可知，以硝酸鈉為氮源時(shí)，脂肽產(chǎn)量最高，可達(dá)2.6 g/L，氯化銨次之。72 h后，添加硝酸鈉和氯化銨的兩組繼續(xù)發(fā)酵，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率較高，而添加有機(jī)氮源的三組停止發(fā)酵。由圖4可知，使用硝酸鈉或氯化銨，表面張力降低值最大，且終點(diǎn)表面張力最小。綜合圖3，圖4可知，無(wú)機(jī)氮源更適合枯草芽孢桿菌的發(fā)酵。

在確定使用無(wú)機(jī)氮源后，為了探索NH4+和 NO3-兩種不同離子形式氮源對(duì)表面活性劑產(chǎn)量的影響，固定總氮量為60 mmol/L，其他組分與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同，分別單獨(dú)使用硝酸鈉和氯化銨，硝酸鈉+氯化銨(1∶1)中，設(shè)置3組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 單種氮源與復(fù)配氮源對(duì)表面張力的影響Fig.5 Effects of single nitrogen source and compound nitrogen source on surface tension

圖6 單種氮源與復(fù)配氮源 對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of single nitrogen source and compound nitrogen source on lipopeptide yield

圖7 單一氮源與混合氮源 對(duì)發(fā)酵液pH的影響Fig.7 Influence of single nitrogen source andmixed nitrogen source on pH of fermentation broth

由圖5可知，3種氮源對(duì)于表面張力的降低幾乎相同。由圖6可知，酸鈉+氯化銨混合氮源，脂肽產(chǎn)量遠(yuǎn)高于以氯化銨為氮源，略高于以硝酸鈉為氮源。從經(jīng)濟(jì)性的角度考慮，氯化銨的價(jià)格較便宜，每噸比硝酸鈉低30%左右，整體可以降低成本。從現(xiàn)場(chǎng)采油工藝考慮，由圖7的 pH值可知，由于氯化銨加入較多，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液pH降低，在采油工藝中，注入地下后，容易腐蝕破壞地層孔隙結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致地層壓力不足，所以發(fā)酵液pH接近中性最好。安全性角度，硝酸鈉有一定的危險(xiǎn)性，用量越少越好。因此，綜合以上4點(diǎn)考慮，選擇硝酸鈉+氯化銨的混合氮源最理想。

2.1.1.3 緩沖對(duì)的優(yōu)化 由于在枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)，中性pH的發(fā)酵液對(duì)地層及周圍環(huán)境也不會(huì)造成污染與損害。因此，為了使pH穩(wěn)定在中性附近，需加入緩沖對(duì)進(jìn)行調(diào)控，常見(jiàn)緩沖對(duì)組合為磷酸酸式鹽，由于鈉離子可以平衡滲透壓，鉀離子可以促進(jìn)表生物表面活性劑合成后的分泌。因此，選擇KH2PO4和12H2O·Na2HPO4作為緩沖對(duì)，調(diào)整培養(yǎng)基pH值至中性，使用KH2PO42.5 g，12H2O·Na2HPO430 g。

2.1.2 碳源、氮源、緩沖對(duì)用量正交優(yōu)化 碳源、氮源、緩沖對(duì)3個(gè)因素在前面進(jìn)行種類優(yōu)化后再進(jìn)行用量的優(yōu)化，碳源和緩沖對(duì)方面，對(duì)比二者不同質(zhì)量濃度對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響，氮源方面，對(duì)比硝酸根型氮源與銨根型氮源不同的比例對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響，因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Horizontal design of orthogonal experimental factors

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of fermentation medium optimization

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance in orthogonal experiment

由表2可知，最佳組合為A3B3C2，因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：蔗糖50 g/L，硝酸鈉∶氯化銨為2∶1，磷酸氫二鈉+磷酸二氫鉀為30 g+2.5 g。脂肽產(chǎn)量可達(dá)4.22 g/L 。由表3可知，RB>RC>RA,各因子對(duì)脂肽產(chǎn)量影響大小為：氮源比例>緩沖對(duì)>蔗糖。其中，氮源比例有顯著影響，碳源和緩沖對(duì)在置信度不低于90%的情況下有一定的影響。

2.2 發(fā)酵條件

2.2.1 溫度條件 溫度主要通過(guò)改變酶反應(yīng)速率來(lái)影響發(fā)酵結(jié)果。溫度過(guò)低，酶活性較低，代謝較慢，產(chǎn)物生產(chǎn)效率也比較低，溫度升高,酶會(huì)因?yàn)檫^(guò)熱而失活，影響菌種生長(zhǎng)發(fā)酵，從而影響最終的脂肽產(chǎn)量[13]。因此，選取細(xì)菌發(fā)酵常用溫度37 ℃，并以3 ℃為間隔，設(shè)計(jì)34,37,40,43,46,49,52,55 ℃作為搖床溫度進(jìn)行發(fā)酵，控制發(fā)酵時(shí)間為96 h，測(cè)量各個(gè)溫度下的脂肽產(chǎn)量,結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，枯草芽孢桿菌在37～45 ℃之間均可良好生長(zhǎng)，并產(chǎn)脂肽，其中發(fā)酵的最適溫度為37 ℃，而在高于49 ℃時(shí)不能進(jìn)行正常生長(zhǎng)發(fā)酵。

圖8 溫度對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of temperature on lipopeptide yield

2.2.2 裝液量 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖需要氧氣參與，當(dāng)裝液量過(guò)少時(shí)，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧過(guò)高，菌體代謝加快，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，造成營(yíng)養(yǎng)失衡，發(fā)酵后期菌體因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)不足而凋亡；而當(dāng)裝液量超出一定范圍后，溶氧量會(huì)顯著降低，菌體有氧呼吸作用受到影響，代謝變慢，從而影響脂肽產(chǎn)量[14]。裝液量對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖9。

圖9 裝液量對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響Fig.9 Influence of liquid loading volume on lipopeptide yield

由圖9可知，裝液量低于150 mL，對(duì)于脂肽產(chǎn)量影響較小，裝液量超過(guò)150 mL時(shí)，脂肽產(chǎn)量下降。因此選150 mL最佳。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間 發(fā)酵時(shí)間對(duì)脂肽產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖10。

圖10 脂肽產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化Fig.10 Variation of lipopeptide yield with fermentation time

由圖10可知，在第100 h時(shí)脂肽產(chǎn)量達(dá)到最大，繼續(xù)發(fā)酵，產(chǎn)量不再增加。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間可確定為100 h。

3 結(jié)論

(1)枯草芽孢桿菌的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：蔗糖50 g/L，NaNO33.4 g/L，NH4Cl 1.1 g，KH2PO42.5 g/L，12H2O·Na2HPO430 g/L，7H2O·MgSO40.8 g/L。

(2)枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，裝液量150 mL，發(fā)酵時(shí)間100 h，脂肽平均產(chǎn)量可達(dá)4.2 g/L。

(3)通過(guò)NH4Cl的加入，減少了NaNO3的用量，在采油工業(yè)中，使每噸氮源成本降低30%左右。實(shí)現(xiàn)了采油枯草芽孢桿菌降低成本、保證產(chǎn)量的發(fā)酵。