基于核磁共振氫譜的組學技術在中藥制藥過程研究中的應用與展望

趙芳 李文竹 潘堅揚 楊嘉譽 瞿海斌

摘要 中藥制藥過程工藝復雜，過程控制水平與產品質量直接相關。進行制藥過程質量評價與質量控制研究，提高制藥過程理解，對保證中藥制劑的安全性與有效性具有重要的意義。隨著核磁共振技術的發展，核磁共振氫譜已在中藥質量評價與代謝組學研究等領域得到廣泛應用。本文主要介紹了氫核磁共振組學技術應用于中藥炮制、提取等制藥過程研究時，在辨識過程化學標志物、研究代謝物在過程中的轉化轉移規律等方面的應用進展，同時展望了基于氫核磁共振技術的過程組學研究在中藥制藥領域的應用前景。

關鍵詞 核磁共振氫譜;組學技術;中藥;制藥過程;質量控制

Application and Prospects of 1H NMR-based Omics Study in Pharmaceutical Processes of Traditional Chinese Medicine

ZHAO Fang1，2，3，LI Wenzhu1，2，PAN Jianyang1，2，YANG Jiayu1，2，QU Haibin1，2

（1 Pharmaceutical Informatics Institute，College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China; 2 Innovation Center in Zhejiang University，State Key Laboratory of Component-Based Chinese Medicine，Hangzhou 310058，China; 3 Hisun Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Hangzhou 311400，China）

Abstract The pharmaceutical process of Chinese medicinal is complex，and the level of process control is directly related to product quality.Carrying out research on the quality evaluation and quality control of the pharmaceutical process and improving the understanding of the pharmaceutical process are of great significance to ensure the safety and effectiveness of Chinese medicinal preparations.With the development of nuclear magnetic resonance technology，hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy has been widely used in the fields of quality evaluation of Chinese medicinal and metabolomics research.This paper mainly introduces the application progress of proton nuclear magnetic resonance omics technology in the research of Chinese medicinal processing，extraction and other pharmaceutical processes，identifying process chemical markers，studying the transformation and transfer law of metabolites in the process，etc.The application prospect of process omics research of proton nuclear magnetic resonance （1H NMR） in the field of traditional Chinese medicine and pharmaceuticals.

Keywords Proton nuclear magnetic resonance （1H NMR）; Omics technology; Chinese medicinal; Pharmaceutical process; Quality control

中圖分類號：R282.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.002

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技術最早被應用于天然產物領域是在20世紀60年代。數十年來，NMR技術的應用范圍得到了不斷拓展。作為一種全面的化學信息獲取技術，NMR能夠用于高通量、定性定量分析中藥制劑及其生產過程中間體的多類化學成分，在有機和生化分子的識別和結構鑒定，復雜混合物中各個化合物的精確定量測定和多組分分析，以及與化學計量學技術結合的代謝組學研究發揮了極大的作用。

在中成藥生產過程中，各工藝單元中發生的化學物質組成變化不清是導致中成藥質量難控的根本原因之一。本文就基于核磁共振氫譜（1H Nuclear Magnetic Resonance Spectra，1H NMR）技術的組學分析在中藥制藥過程研究中的應用及展望進行綜述。

1 中藥制藥過程質量控制

為克服現有質量標準的不足，提高質量一致性、可控性和溯源性，劉昌孝院士提出了中藥質量標志物（Quality Marker，Q-Marker）的概念[1]，明確了Q-Marker應具有“存在性”“特有性”“可測性”“功效關聯性”以及“溯源和傳遞性”5大特點，進一步明確了中藥質量認識、質量評價和質量控制應著眼于中藥形成全過程的質量屬性及物質基礎的復雜、動態變化規律，即質量“傳遞與溯源”的要求，以期實現闡明最終藥效物質基礎和建立可溯源的全程質量控制體系的目的[2]。中藥所含的化學成分較為復雜，在臨床上應用時，多種成分協同起效，但也有一些成分可能導致不良反應的產生，因此僅對少數幾個藥效成分的檢測和控制并不能保證中藥的安全性。一些中藥特殊劑型，如中藥注射液，其冗長的、復雜的生產工藝流程中，各工藝單元中化學物質組成變化不清，同時存在藥材質量的批次或產地等差異，制藥過程全成分監測困難，過程理解不易，導致其質量控制難度大大提高[3-4]。藥品質量源于設計（Quality by Design）[5]的理念已在中藥領域引起廣泛重視，通過獲取中藥制藥過程各工藝單元化學信息，分析各工藝單元前后綜合化學信息與關鍵質量屬性的變化情況，揭示生產工藝的內在規律，提高中藥制藥的過程理解，進而實現過程控制，使制藥過程波動與風險可控，是進一步提高中藥質控水平、推進中藥制造智能化的重要途徑。

隨著分析化學、計算機輔助技術與化學計量學的迅猛發展，中藥質量分析技術已逐步發展為定量分析（藥效成分、活性成分、指標成分或主要化學成分，以及有毒有害成分）與色譜指紋圖譜、紅外（Infrared，IR）、近紅外（Near-infrared，NIR）等光譜分析并重的質量分析模式[6-7]。現行的中藥質量分析著眼于藥效成分、活性成分、指標成分或主要化學成分的定量分析及指紋圖譜相似度評價，主要采用色譜分析技術，而針對中藥制劑中的糖類、氨基酸、有機酸、核苷等初生代謝產物的檢測與控制則較為少見。

針對中藥制劑中初生代謝物的分析，高通量的核磁共振技術進入了研究人員的視野[8-9]。1H NMR波譜中，相應信號的位置和強弱反映了檢測對象中含氫元素的代謝物的結構特征和相對含量[10]，是有機化合物結構鑒定、反應動力學研究及植物代謝組學研究等領域的重要技術方法。PMR在中藥材、中藥提取物及中藥制劑的研究中具有諸多優點[11-15]：樣品無需復雜預處理，前處理簡便且能夠保留待測樣品的理化特征;分析脈沖多樣化，檢測適用范圍廣;分析過程快速;光譜化學信息豐富，可解釋性高;通過內標或外標法輔助可實現定量核磁共振（Quantitative Nuclear Magnetic Resonance，qNMR）分析技術;NMR儀器性能穩定，重現性好，精密度高，構建的方法穩健性強。綜上所述，NMR技術在中藥制藥過程全成分分析中優勢顯著，適合作為中藥制劑生產過程質量控制方法研究的有力工具。

2 基于1H NMR組學技術的中藥制藥過程分析

近年來，基于NMR技術的植物代謝組學研究發展飛速，也在中藥領域得到廣泛應用[13，16-17]。植物代謝組學通過檢測并分析植物體在內、外因刺激施加前后的代謝物狀態，結合多元統計分析與模式識別技術，量化并解釋內外因導致的植物體代謝變化，進而發現代謝過程的關鍵生物標志物（Bio-marker）及其代謝通路，為探究中藥的重要次級代謝產物的合成、轉化、積累規律與機制等提供了有效的方法，為提高中藥材的產量和質量提供了理論參考。對于中藥制藥過程，可參考代謝組學的基本流程與分析手段，構建中藥制藥過程組學方法，即通過中藥制藥過程代表性樣本采集、NMR分析與數據采集、數據處理、化學計量學分析、化學標志物（Chemical-marker）篩選等，對工藝中間體化學組成進行全面分析，闡明中藥中各類代謝物在制藥過程中各工藝環節內的動態變化規律，促進對制藥過程的科學理解，探究工藝過程的本質。基于NMR的中藥制藥過程組學分析流程。見圖1。

2.1 過程工藝中間體的獲取 對中藥制藥過程進行組學分析，首先需要獲取相應工藝過程的原料與產物，即過程中間體（Process Intermediates）。對于制藥過程的組學研究，可在工業規模下的生產過程中進行定點取樣，獲取過程中間體并留樣分析;也可在直接小試或者中試規模下進行工藝模擬，制備得到過程中間體并進行NMR分析。

2.2 測試樣品的配制 根據待測工藝中間體的溶劑極性及成分屬性，選擇合適的氘代試劑對樣品進行化學標記。部分樣品可直接加入一定比例的氘代試劑后進行NMR分析;部分樣品需要進行簡單的預處理，以提高代謝物的信號響應，或避免原始樣品中的溶劑信號對代謝物信號產生干擾。如，部分中藥制藥工藝需要使用乙醇作為溶媒，此類樣品若直接進行NMR分析，則采集到的NMR光譜中乙醇的特征信號響應極強，其余代謝物的信噪比將受到顯著影響，不利于后續數據分析。針對此類樣品，可通過真空凍干或真空離心濃縮等方式揮干溶劑，再使用氘代甲醇或氘代水將樣品復溶后進行NMR分析。

2.3 NMR光譜的采集及處理 在NMR光譜采集過程中，為獲得化學信息豐富的NMR圖譜，需要優化儀器操作程序與采集參數，如勻場程序、溫度控制、數據采集時間、脈沖角、分辨率、激發偏置（O1P）、弛豫延遲時間（D1）、采集次數（NS）以及接收器增益值（RG）等，進行選擇與優化。如，樣品濃度偏低時，可以通過提高RG及增加NS;選擇合適的D1（D1應該是自旋晶格弛豫T1的7倍以上）以保證定量結果的準確性;將O1P設置于全譜的中心，以避免邊緣信號的形變;優化采集溫度，避免樣品在光譜采集過程中持續受熱，導致信號漂移、信噪比降低[18]。由于不同樣品的原始NMR光譜間可能存在的信號漂移、線寬變化等差異，不利于后續的數據分析，因此還需對光譜進行預處理，包括充零、相位矯正、基線校正、信號對齊、分箱（Binning）處理、譜線解卷積或線性擬合、調整譜線增寬（LB）參數、信號對齊等，使得不同樣品間的光譜基線形態、信號分布、峰形與峰寬等實現相對一致，提高不同樣品NMR光譜間的可比性，減小系統誤差，提高定量結果準確性。如，中藥制劑成分復雜，NMR光譜中常有多個代謝物的部分結構與氫原子化學環境相似，對應的特征信號發生重疊，對后續分析產生干擾，此時需要通過線性擬合或解卷積獲取單個特征峰的準確峰面積[19];同類樣品間的pH值與離子濃度可能因為代謝物濃度、比例的不同而存在差異，導致NMR光譜間存在代謝物特征峰偏移，此時可采用CluPA[20]或ICOSHIFT[21]等方法進行光譜對齊。

2.4 化學計量學分析 過程中間體的NMR光譜經處理后得到數據矩陣X（m×n）用于化學計量學分析，其中為m工藝中間體的數量，n為變量數（NMR光譜經降維處理后的數據點數）。常用的化學計量學方法包括非監督的模式識別法，如主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、層次聚類分析（Hierarchical Classification Analysis，HCA）方法，以及有監督的模式識別方法，如偏最小二乘判別分析法（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）或正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least Square-Discriminant Analysis，OPLS-DA）等[22]。其中，PCA和HCA通常用于獲取所有樣本的全局分布概貌，通過得分圖等工具進行無監督的分類來觀察不同樣品之間的異同，從而分析不同工藝條件對樣品化學組成的影響;PLS-DA和OPLS-DA等則基于既定的樣本類別建立模型，進而通過相應統計量來辨識模型的關鍵變量，并通過光譜信號歸屬確定這些變量所對應的代謝物，將其視作相應過程的潛在化學標志物，認為這些代謝物在該工藝過程中變化較大，存在著可能的轉移、轉化現象，是潛在的工藝中間體關鍵質量屬性。

2.5 過程表征與過程理解 基于對過程化學標志物的辨識結果，通過對相應NMR信號峰進行解卷積積分，對化學標志物進行定量或半定量分析，獲得代謝物在過程中的含量變化趨勢，辨析不同工藝過程及過程參數對代謝物的影響程度，從而對其在制藥過程中的溶出、沉淀、降解、聚合等轉移或轉化規律進行推斷，即可在代謝物層面實現對工藝過程的表征，進而加深對工藝過程的理解。

3 基于NMR的組學技術在中藥制藥過程中的應用

中藥炮制過程是中藥材增效減毒的重要手段。在炮制過程中，中藥化學成分經常發生變化，炮制品的質量關乎中醫藥臨床療效的發揮[23]。NMR技術應用于炮制過程研究時，有助于加深對炮制前后藥品成分變化的認識，挖掘炮制前后中藥材的藥效或活性差異的內在原因。Li等[24]采用NMR技術研究了柴胡的醋制過程，通過對不同醋制前后柴胡樣品的1H NMR光譜數據的多變量分析，解析了由醋制引起的柴胡中10種初生代謝物與6種次生代謝物的變化，并闡述了不同醋制條件對柴胡中代謝物含量的影響規律。Zhao等[25-26]對金銀花的炒炭法炮制過程進行了研究，分析金銀花經過不同溫度及時間的碳制處理后NMR光譜中各特征信號，通過熱圖分析法及PCA得分圖定性分析碳制工藝過程中特征信號的變化規律;在此基礎上，通過柱色譜法分離了5個特征代謝物，分別為綠原酸、肌醇、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C，并定量分析其在不同加熱條件下的變化規律。Zhai等[27]通過辨識白術經麩炒后其1H NMR光譜中特征信號的變化，發現并鑒定了5個新特征代謝物，并解析了特征代謝物的結構與來源。Li等[28]基于1H NMR光譜分析了鹿茸中52種常見代謝物在經熱水煮炸法炮制后的變化情況，采用PCA及OPLS-DA法辨識出過程的11個化學標志物，包括丙氨酸、苯丙氨酸、尿苷、尿嘧啶、膽汁酸、膽堿等。王雪潔等[29]對生遠志、蜜遠志和甘草制的遠志進行了1H NMR代謝組學分析，證明了炮制會改變遠志的藥用特性;Dai等[30]采用NMR代謝組學技術研究不同干燥方式下丹參藥材中次級代謝產物的變化規律，發現晾干能夠促進莽草酸介導的多酚酸類成分的合成，而曬干會抑制多酚酸的產生;李藝等[31]采用基于1H NMR的代謝組學技術結合多元統計分析對細辛及米醋制細辛、老陳醋制細辛的化學成分進行比較分析，從而探究傳統理論中細辛入藥時需用老陳醋炮制的理論依據;李震宇等[32]采用方差分析及OPLS-DA法對白芍及其2種醋制品的化學成分進行了比較分析，探討了炮制用醋種類對白芍醋制后化學成分的影響。此外，對于黃芪[33]、地黃[34]、款冬花[35]、大海馬[36]、柴胡[37]以及王不留行[38]等中藥的炮制過程，也有研究者開展了基于1H NMR組學技術的代謝物變化研究。以上研究均表明基于NMR技術，可以闡釋炮制工藝過程中多類別特征代謝物變化規律，能夠為中藥炮制工藝現代化標準加工規程與質量控制標準的制定提供新的思路與方法。

中成藥制備過程經常包含提取、濃縮、醇沉等工藝單元，由于中藥化學成分復雜，目前對這些工藝單元開展中藥制藥過程組學研究還不多。Li等[39]在丹參提取工藝表征研究中引入組學分析技術，以1H NMR光譜為分析工具，對不同組成溶媒提取的丹參提取物進行質量表征，采用PCA、OPLS-DA和HCA等多變量數據分析技術，解釋了丹參提取液中各類代謝物的濃度隨乙醇濃度的變化趨勢，并通過OPLS-DA法識別出不同溶劑中的溶出規律有顯著不同的代謝物，將其視作過程表征中的特征代謝物。在此基礎上，基于光譜解卷積技術，使用半定量1H NMR方法獲得了特征代謝物的相對濃度信息，進一步說明了不同溶劑組間的代謝物溶出規律變化。該研究表明了基于NMR技術的中藥制藥過程組學方法可表征中藥提取過程，幫助闡明代謝物在提取工藝中溶出規律。Zhao等[40]通過對丹參川芎嗪注射液生產過程中工藝中間體的1H NMR光譜進行HCA、OPLS-DA分析，辨識生產過程中的關鍵質控工藝，以及相關工藝的潛在化學標志物。此外，Zhao等[41]以基于1H NMR的OPLS-DA法辨識了丹參醇沉工藝的化學標志物，在此基礎上結合實驗設計法（Design of Experiment，DoE）獲取具有代表性的醇沉上清液，基于半定量1H NMR法考察不同的工藝參數對化學標志物在醇沉工藝中保留情況的影響。以上研究說明NMR光譜法具有揭示中藥生產全過程中各類化學物質轉移、轉化規律及識別潛在化學標志物的能力。

4 展望

將基于1H NMR的組學技術引入到中藥制藥過程研究中，通過獲取中藥制劑及工藝中間體的NMR分析數據，結合網絡數據庫及NMR化合物信息，可發現中藥制劑及工藝中間體中所含的化學成分，結合基于化學計量學與模式識別等多變量數據分析工具，可用于全面、整體、定量地評估各類初生、次生代謝物在制藥過程中的動態變化，發掘各工藝單元中化學標志物，闡明其轉移轉化規律，同時有助于考察各工藝條件對化學標志物的影響程度及影響規律，以實現對化學標志物的全過程追溯。

基于1H NMR的制藥過程組學技術，將有望為中藥生產過程表征以及深入過程理解提供方法，包括但不限于構建中成藥代謝物NMR數據庫，生藥炮制工藝的研究與優化，中成藥制藥過程全流程Q-Marker及其他化學標志物的轉移轉化規律研究，基于qNMR技術的工藝過程監測與過程控制，工藝表征與工藝優化，中藥制劑貯存過程全成分轉化、降解規律研究等。這為探究工藝過程的本質，為制定與提升中藥制劑的質量控制標準提供參考，在中藥制藥過程研究中具有較大的研究價值與應用前景。

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（2021-10-25收稿 責任編輯：王明）