利用生物信息技術分析iASPP與P53靶基因在肝癌中的臨床意義

敖楓華 邱 楊 熊文敏 姚景亮 涂子為 葉新芊 李國慶 彭世義

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤中死亡率居第三位[1]，具有高發病率、高死亡率、惡性程度高等特點，屬于難治性腫瘤，其發病機制不明，與病毒感染相關。目前，肝癌的主要的治療方法有手術、肝介入栓塞化療及全身化療。對于早期的患者手術切除結合其他輔助治療能顯著延長生存；但由于我國腫瘤普查的欠缺，大部分肝癌患者確診時為晚期，化療效果差，生存期短，預后極差。近年來，雖然以索拉非尼為代表的靶向治療開辟了肝癌治療的新思路，但是臨床試驗證明索拉非尼對肝癌切除或消融后的輔助治療不是有效的干預措施，無法改變治療現狀[2]。因此，探究肝癌的發病機制，發現新的靶點，開發新的藥物對改善肝癌患者的預后尤為重要。

基因芯片技術是近年來的熱門話題，隨著人類基因組計劃的進展，基因序列數據已經逐步向科研與臨床方向推進，該技術將大量的探針固定于支持物上并與標記的樣本進行雜交，通過檢測每個探針的雜交信號強度來獲得序列信息。本研究搜集了肝細胞癌測序與臨床數據信息，探究其預后基因，研究是否可開發基因治療藥物。

P53凋亡刺激蛋白抑制劑(inhibitor of apoptosis stimulating protein of p53，iAPSS)，也被稱作PPP1R13L，屬于ASPP家族。ASPP家族包括Aspp1、Aspp2和iASPP，它們能相互競爭與P53結合，調控P53家族蛋白的功能[3-4]。Aspp1、Aspp2屬于P53家族蛋白的刺激因子，可以與P53、P63等結合，增強其促細胞凋亡作用，屬于抑癌基因；而iASPP與P53結合，抑制P53的功能，其過度表達抑制DNA損傷后P53家族蛋白啟動的細胞凋亡，從而導致腫瘤的發生和發展，屬于癌基因[4-6]。由于不同組織中ASPP家族蛋白表達的差異，P53的純合性并不代表對腫瘤發生的抵抗性，只有結合ASPP蛋白家族才能明確P53表達與腫瘤發生的關系[7]。

關于對iASPP與P53蛋白相互作用的結構研究發現，iASPP優先結合P53脯氨酸富集區域，P53脯氨酸富集區域是P53與DNA序列結合調控靶基因翻譯轉錄的結構。iASPP與P53脯氨酸富集區域結合，參與P53對下游基因轉錄調控的作用[8]。最近有研究報道，iASPP參與P53轉錄調控的靶基因包括：AEN、FAS、FHL2、PMAIP1、AEN、FAS、FHL2、PMAIP1、RPS27L、ZMAT3、ACTA2、HES2、SLC30A1、BAX、BBC3、DRAM1和MDM2[9]。然而iASPP過表達對于P53靶基因的影響卻鮮少報道，P53靶基因對iASPP參與腫瘤預后的作用并不清楚。

本文聯合利用Oncomine、TCGA、Human Protein Atlas數據庫評估iASPP在肝癌中的表達及其與肝癌患者預后的關系，并探索iASPP的高表達是否影響P53靶基因的表達。通過數據庫分析P53靶基因的表達對預后的影響。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數據庫分析

將iASPP基因在不同類型癌癥中的表達水平在Oncomine數據庫(https：//www.Oncomine.org)中進行了鑒定，根據P值為0.001，倍數變化為1.5，基因排序確定閾值。

1.2 TCGA數據庫分析

進入TCGA主頁(http：//cancergenome.nih.gov/)下載HCC癌組織芯片信息，獲取臨床樣本信息及RNA-seq數據，將部分數據不完整的患者篩除，共篩選出293例患者信息。

1.3 STRING數據庫分析

進入STRING網站(https：//string-db.org/)，構建iASPP與研究的P53靶基因的網絡圖，挖掘相關基因調控網路，探索網路構成與肝癌發生發展的關系。

1.4 統計分析

在Oncomine中生成的正常肝組織患者和肝癌患者列組及2組之間生存信息差異的P值。使用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理。生存分析利用Kaplan-meier分析方法，2組之間表達水平的差異用獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 iASPP基因在肝組織中的表達水平

使用Oncomine數據庫分析了HCC腫瘤和正常肝組織中的iASPP mRNA水平，結果表明，與正常組織相比，肝癌組織中iASPP表達更高(P=0.001)(圖1)。

圖1 iASPP基因在肝組織中的表達情況

2.2 iASPP對HCC預后的影響

根據患者iASPP表達量中位數，將患者分為iASPP高表達組(n=147)和低表達組(n=146)，使用Kaplan-Meier分析這2組患者的預后差異，結果顯示iASPP高表達組預后較差(OS：P=0.042；PFS：P=0.175)(圖2)。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析iASPP高表達組和低表達組肝癌患者的預后

2.3 iASPP蛋白對P53家族蛋白的調控功能

在STRING網站上構建iASPP的蛋白相互作用網絡圖，可以看到iASPP蛋白可以調控P53蛋白的功能，與iASPP直接相關的蛋白有FHL2、MDM，在后續研究中可以重點關注(圖3)。

圖3 iASPP蛋白相互作用分析網絡

2.4 iASPP的表達水平對HCC患者P53靶基因表達的影響

我們運用t檢驗比較iASPP高表達組和低表達組中P53靶基因表達水平的差異(圖4)，發現iASPP高表達組PMAIP1(圖4A)(P=0.021)、RAP2B(圖4B)(P=0.001)、BBC3(圖4C)(P=0.001)、HES2(圖4D)(P=0.006)水平顯著高于iASPP低表達組，而2組ACTA2(圖4E)、BAX(圖4F)、CDKN1A(圖4G)、FHL2(圖4H)、MDM2(圖4I)、RPS27L(圖4J)、DRAM1(圖4K)、TIGAR(圖4L)水平無顯著差異。

圖4 iASPP高表達組和低表達組P53靶基因的表達差異

2.5 P53靶基因的表達量與預后的關系

為了進一步探索有顯著差異的靶基因表達量與HCC總體生存是否相關，我們利用Human Protein Atlas數據庫分析了PMAIP1、RAP2B、BBC3、HES2表達量與肝癌的生存的關系(圖5)，發現PMAIP1(P=0.0020)、RAP2B(P=0.00016)、HES2(P=0.00026)高表達患者整體生存較低表達患者差，而BBC3(P=0.14)表達與整體生存關系不顯著。這與我們前面的結果一致，iAPSS高表達患者組PMAIP1、RAP2B和HES2水平顯著升高，且預后較差。

圖5 P53靶基因的表達量與HCC患者總生存率的關系

3 討論

在本研究中，我們利用生物信息學分析了肝癌患者iASPP的表達與預后的關系，并且結合P53作為轉錄因子作用，分析iASPP對P53靶基因表達的影響，及P53靶基因對肝癌患者生存的意義，深入挖掘iASPP參與肝癌患者預后作用的機制。

越來越多的研究發現腫瘤下調P53通路不限于P53基因的突變，還能通過iASPP表達升高抑制P53功能及信號通路，促進腫瘤的發生。最近的研究也報道了iASPP在許多腫瘤中的異常表達，包括膀胱癌[10]，非小細胞肺癌[11]，卵巢透明細胞癌[12]，大腸癌[13]，特別是在P53突變相對罕見的急性白血病[14-15]。同這些研究的結果相似，我們的研究也發現iASPP在肝癌表達升高，并且高表達的患者整體生存更差。

作為P53的調節因子，iASPP間接影響P53下游基因的表達，促進癌基因表達并抑制抑癌基因的表達。

本研究發現，iASPP高表達組患者較iASPP低表達組患者PMAIP1、RAP2B、BBC3、HES2顯著升高。PMAIP1本身并不是癌基因，主要作用是對抗DNA損傷后p53介導的凋亡[16]，RAP2B在研究中被證明影響腫瘤的黏附和增殖[17]，BBC3是一個控制凋亡的效應子，HES2則在發育過程中起到了多效性作用。利用Human Protein Atlas數據庫分析，發現RAP2B、RAP2B、HES2的高表達影響肝癌預后。這與iASPP高表達患者預后較差的結果相一致，表明高水平的iASPP可以通過結合P53，調控P53靶基因的表達，從而促進腫瘤增殖，影響患者生存。

總之，根據TCGA、Human Protein Atlas和Oncomine數據庫的生物信息學分析，我們明確了iASPP的高表達影響肝癌預后，且iASPP高表達對P53靶基因的影響可能是其導致HCC預后不良的機制。這一發現有助于我們進一步了解P53通路對影響肝癌發生的機制，為進一步研究該病的治療及預后提供了指導。在肝癌患者中，iASPP與P53靶基因的相互作用，以及其信號通路仍有待基礎研究的驗證。