MicroRNA-122結(jié)合區(qū)遺傳變異IL1A rs3783553與原發(fā)性肝癌預(yù)后的關(guān)系研究

陳雪琴 張建龍 萬祥輝 魏小勇

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是國內(nèi)外最常見和預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新數(shù)據(jù)顯示，2017年肝癌全球新發(fā)病例95萬，位列第六；死亡病例82萬，位列第四[1]。近年來，肝癌的診治技術(shù)雖得到不斷提升，但肝癌患者的預(yù)后仍然較差，5年生存率甚至低于10%[2]。研究表明，肝癌的預(yù)后與腫瘤大小、數(shù)量、細(xì)胞分化程度、血管侵犯及炎癥程度顯著相關(guān)[3]，但即便沒有這些重要因素的影響，肝癌的死亡率仍不盡人意。因此，尋找新的預(yù)測標(biāo)記物對改善肝癌患者預(yù)后具有十分重要的意義。

白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)家族是由IL-1A、IL-AB及IL-1RA組成的重要炎性細(xì)胞因子。研究表明，IL-1通過調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)與惡性腫瘤細(xì)胞的相互作用模式，在腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵犯及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一類具有RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)功能的短鏈非編碼RNA分子，它通過結(jié)合目的mRNA的3'UTR區(qū)發(fā)揮調(diào)控功能[6]。以往的研究表明，位于3'UTR區(qū)的遺傳多態(tài)通過破壞miRNA與mRNA的結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)[7]。大量的流行病學(xué)研究顯示，位于IL-1A基因3'UTR區(qū)的遺傳變異位點rs3783553與宮頸癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌及肝癌的發(fā)病風(fēng)險顯著相關(guān)[8-9]。我們以往的研究也表明rs3783553與慢性乙肝病毒感染風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)，但目前對它在肝癌預(yù)后中的作用研究較少。基于rs3783553在慢性乙肝病毒感染及肝癌中的重要作用，我們通過隊列研究的方法對rs3783553與肝癌預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2011年9月至2014年5月期間，我們嚴(yán)格按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇了510例在江西省腫瘤醫(yī)院確診的原發(fā)性肝癌患者作為研究對象。納入的研究對象均是首次確診的HCC患者，無惡性腫瘤病史且未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。研究對象的人口學(xué)資料由經(jīng)培訓(xùn)的研究員調(diào)查獲得，臨床資料來源于醫(yī)院電子病歷，隨訪資料由專門的隨訪員進(jìn)行調(diào)查記錄。患者出院后每3個月進(jìn)行一次隨訪。我們的研究在取得江西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)下進(jìn)行。在研究對象知情同意后，對每位患者抽取1ml外周血用于基因分型。

1.2 基因型分析

首先采用百泰克凝固血基因組DNA小量提取試劑盒經(jīng)過一系列步驟提取血樣中的DNA。利用低通量基因分型方法TaqMan對所有樣本進(jìn)行分型。引物探針合成后，按照說明配置PCR反應(yīng)體系，并將其加至384孔板中，每一個384孔板均設(shè)置4個陰性對照。采用ABI公司的9700高速基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，嚴(yán)格控制PCR的反應(yīng)條件，隨機(jī)抽取6個孔的樣本進(jìn)行凝膠電泳實驗以檢測PCR的質(zhì)量。在7900HT熒光定量PCR儀上進(jìn)行基因分型，采用SDS2.4軟件讀取分型后的數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

患者的死亡時間定義為首次治療時間至死亡時間或最后一次隨訪時間。采用顯性、隱性及加性三種遺傳模型對遺傳變異位點的作用進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗用來估計和比較不同基因型的生存曲線，采用Cox比例風(fēng)險回歸校正年齡、性別、吸煙情況及TNM分期的混雜影響，計算遺傳變異位點rs3783553的校正HR (hazard ratios，HR)值及95%可信區(qū)間(confidence internal，CI)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0軟件包進(jìn)行分析，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究人群的基本情況與預(yù)后分析

本研究共納入510例原發(fā)性肝癌患者，其人口學(xué)特征及臨床資料如表1所示。研究對象的年齡中位數(shù)為52歲，男性患者占86.27%，吸煙患者占43.5%。本研究的中位隨訪時間為35.5個月，共有289例患者在隨訪期間因肝癌死亡，死亡率為56.7%。單因素比例風(fēng)險回歸分析顯示：年齡(HR=1.32，95%CI=1.04～1.66)和腫瘤分期(HR=5.38，95%CI=4.18～6.94)與肝癌患者死亡風(fēng)險存在顯著相關(guān)性。

表1 研究人群的基本特征與預(yù)后分析(例，%)

2.2 基因分型結(jié)果及生存曲線分析

基因分型結(jié)果顯示，在研究對象中存在缺失/缺失(Del/Del)、缺失/插入(Del/Ins)和插入/插入(Ins/Ins)三種基因型分布。510例研究對象中共有492例分型成功。不同基因型患者的生存情況如圖1所示。Del/Del基因型HCC患者中位生存期為41.1個月，Del/Ins+Ins/Ins基因型HCC患者中位生存期為43.8個月。Log-rank檢驗比較兩者的生存曲線顯示，攜帶Del/Del基因型患者生存率與Del/Ins+Ins/Ins基因型患者的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.994)。

圖1 rs3783553不同基因型肝癌患者生存曲線

2.3 遺傳變異位點rs3783553與肝癌死亡風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性分析

遺傳變異位點rs3783553在HCC人群中的分布及其與HCC死亡風(fēng)險之間的關(guān)系分析如表2所示。在多因素Cox回歸模型中經(jīng)過對年齡、性別、吸煙情況及腫瘤分期進(jìn)行校正后，尚未發(fā)現(xiàn)rs3783553不同基因型患者與肝癌死亡風(fēng)險相關(guān)(顯性模型：HR=0.92，95%CI=0.71～1.19；加性模型：HR=0.91，95%CI=0.76～1.11)。我們進(jìn)一步對年齡、性別、吸煙及腫瘤分期情況進(jìn)行分層分析，在顯性模型中運用Cox回歸模型對其他因素校正后，未發(fā)現(xiàn)rs3783553與肝癌死亡風(fēng)險相關(guān)(表3)。

表2 rs3783553基因型頻率分布及其與HCC死亡風(fēng)險的關(guān)系

表3 顯性模型中rs3783553與HCC死亡風(fēng)險關(guān)聯(lián)分層分析

3 討論

MicroRNA-122是肝臟中最豐富的miRNA，約占所有miRNA種群的70%[10]。越來越多的證據(jù)表明microRNA-122在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，血清中microRNA-122的表達(dá)水平與肝癌的預(yù)后風(fēng)險顯著相關(guān)[11]。體外的研究表明，microRNA-122可作為腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)移[12]，肝癌組織中microRNA-122表達(dá)的缺失可增強(qiáng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移屬性[13]。MiRNA的作用形式主要是通過與mRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)mRNA水平與蛋白質(zhì)的表達(dá)，而這種結(jié)合可被位于miRNA結(jié)合位點上的遺傳多態(tài)所影響。本文主要探討的是位于microRNA-122結(jié)合位點上的遺傳多態(tài)在肝癌預(yù)后中的作用。

2009年，研究者們發(fā)現(xiàn)位于IL-1A 3'UTR區(qū)功能性多態(tài)位點rs3783553可通過改變與microRNA-122與miRNA378結(jié)合，影響IL-1A的表達(dá)。Gao等的研究表明rs3783553插入(TTCA)基因型可顯著降低原發(fā)性肝癌的易感風(fēng)險，TTCA基因型的缺失可增強(qiáng)IL-1A與microRNA-122與microRNA-378的結(jié)合，抑制IL-1A的表達(dá)，削弱了IL-1A在腫瘤發(fā)展中的免疫調(diào)節(jié)作用[14]。隨后的研究也發(fā)現(xiàn)攜帶rs3783553插入(TTCA)等位基因的人群患鼻咽癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌及結(jié)直腸癌的風(fēng)險顯著降低[15]，且缺失等位基因型癌細(xì)胞的惡性程度顯著升高。同時，在我們此前的研究中也顯示遺傳變異位點rs3783553與慢性乙肝病毒感染風(fēng)險存在顯著關(guān)聯(lián)。因此，IL-1A rs3783553可能作為肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的遺傳標(biāo)記物。基于此種假設(shè)，我們運用隊列研究的方法對rs3783553與肝癌預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行了探討，尚未發(fā)現(xiàn)rs3783553不同基因型患者與肝癌死亡風(fēng)險相關(guān)。

我們的研究首次從miRNA的角度出發(fā)，探討了位于microRNA-122靶基因IL-1A 3'UTR區(qū)功能性多態(tài)位點rs3783553與肝癌預(yù)后之間的關(guān)系。研究表明，雖然rs3783553與慢性乙肝病毒感染與肝癌的發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)，但不是肝癌死亡風(fēng)險的影響因素。本研究是一項前瞻性的隊列研究，受樣本量和隨訪時間的影響研究結(jié)果具有一定的局限性，仍需更大樣本量的研究進(jìn)行進(jìn)一步論證。