注射用神經節苷脂鈉對癲癇持續狀態大鼠認知功能障礙及神經炎癥的改善作用及機制▲

歐詒丹 陳 靜 高元杰

(海南省儋州市人民醫院神經內科，儋州市 571700，電子郵箱：flower1988@163.com)

癲癇是一種由大腦神經元異常過度放電引起的反復發作的神經系統疾病[1]。癲癇發作持續30 min以上，或在短時間內頻繁發作而不能自止的狀態，稱為癲癇持續狀態[2]。若癲癇持續時間過長或多次反復發作，可造成不可逆的腦損傷，導致患者認知功能障礙[3]。丙戊酸鈉、卡馬西平和苯妥英鈉等是目前臨床常用的抗癲癇藥物，但仍有20%～30%的癲癇患者經治療后還會頻繁發作并發展為難治性癲癇[4]。同時，常規抗癲癇藥物伴存在多種不良反應，這些不良反應也影響了患者服藥的依從性。因此，尋找療效較好且副作用小的抗癲癇藥物成為當前迫切需要解決的問題。神經節苷脂鈉注射液為治療中樞神經系統損傷性疾病的常用藥，癲癇持續狀態是造成患者神經損傷的主要病因，神經節苷脂鈉能夠穿透血腦屏障，有效促進神經功能恢復[5-7]。近年來，大量研究顯示癲癇發作引起的神經炎癥反應是導致腦組織病理改變以及認知功能損傷的重要原因[8-10]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)-髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號通路在癲癇發生和發展過程中發揮著重要作用[9]，深入研究其與神經炎癥及癲癇發作的關系，有利于進一步闡明癲癇發病的機制。本研究主要分析注射用神經節苷脂鈉對氯化鋰-毛果蕓香堿誘導的癲癇持續狀態大鼠認知功能障礙及神經炎癥的改善作用并基于TLR4-MyD88通路探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物及試劑 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液(20 mg/支)購自北京賽升藥業股份有限公司(批號：20193881)；丙戊酸鈉片(500 mg/片)購自山東仁和堂藥業有限公司(批號：20200427)；氯化鋰(100 g/瓶)購自國藥集團化學試劑有限公司(批號：310468)；鹽酸毛果蕓香堿(5 g/瓶)購自上海邁瑞爾化學技術有限公司(批號：1538901CAS)；溴甲基東莨菪堿(25 mg/瓶)購自上海禾豐制藥有限公司產品(批號：190213)；地西泮(2 mL/10 mg)購自上海旭東海普藥業有限公司(批號：190301)。Nissl染色試劑盒購自上海生工生物工程有限公司(批號：1922S04)；白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海酶科(批號：20200125、20200311、20200214)；總蛋白提取試劑盒購自Sigma公司(批號：017K6145)，TLR-4抗體、核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)抗體、MyD88抗體、β-肌動蛋白抗體購自R&D公司(批號：220645、223712、220428、220635)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司(批號：ab205811)。

1.2 主要儀器 WMT-100水迷宮視頻跟蹤分析系統(成都泰盟軟件有限公司)；RM 2235石蠟切片機(Leica公司);ChemTron KSW 光學顯微鏡(Leica公司)；RT-6500型酶標儀(深圳雷杜公司)；-80℃超低溫冰箱(SANYO公司)；電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物及分組：無特定病原體級雄性SD大鼠60只，體重(200±20) g，6～8周齡。大鼠購自海南藥物研究所有限責任公司[動物許可證號:SYXK(瓊)2020-0007]，飼養于20℃～25℃、相對濕度為50%～65%的環境中，實驗前適應性飼養1周。稱大鼠體重后，將不同體重的大鼠采用隨機區組方法分為空白組、模型組、陽性對照組、神經節苷脂鈉組，每組15只。

1.3.2 模型制備：采用腹腔注射氯化鋰-毛果蕓香堿建立癲癇大鼠模型[10]。取模型組、陽性對照組及神經節苷脂鈉組大鼠，均先給予氯化鋰(127 mg/kg)腹腔注射，18～20 h后給予毛果蕓香堿(30 mg/kg)腹腔注射，注射毛果蕓香堿前30 min給予溴甲基東莨菪堿(1 mg/kg)腹腔注射以減輕膽堿能外周反應。注射毛果蕓香堿后立即觀察各組大鼠的行為表現，根據Racine分級標準[11]判定大鼠是否出現癲癇發作。其中，正常狀態為0級；面部肌肉抽動痙攣為Ⅰ級；Ⅰ級+頸部肌肉痙攣為Ⅱ級；Ⅱ級+前肢痙攣為Ⅲ級；Ⅲ級+后肢站立為Ⅳ級；Ⅳ級+身體向后跌倒、四肢抽動為Ⅴ級。若癲癇未發作或發作未達到Ⅳ級，則每隔30 min腹腔注射毛果蕓香堿一次(10 mg/kg)，直至出現癲癇持續狀態。癲癇發作達到Ⅳ～Ⅴ級并持續達30 min者為造模成功。發作持續1 h后腹腔注射地西泮(10 mg/kg)以終止發作。空白組給予腹腔注射等容量生理鹽水。

1.3.3 給藥方式：造模成功后第1天，給予空白組、模型組及神經節苷脂鈉組大鼠經腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，將大鼠固定于ZS-B型大鼠立體定位儀，切開頭皮，暴露顱骨,以右側海馬CA3 中心區為注射靶點，用微量注射器給予神經節苷脂鈉組大鼠注射神經節苷脂鈉注射液20 μL，每隔10 d注射1次，連續注射3次；空白組、模型組于同時間注入等容量無菌生理鹽水，完成注射后留針5 min，退針后縫合頭皮。陽性對照組給予丙戊酸鈉(400 mg/kg)腹腔注射，3次/d，連續30 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 Morris水迷宮實驗：(1)定位航行實驗。采用WMT-100型水迷宮進行實驗。于給藥第40天開始對各組大鼠進行訓練及測試。將大鼠面朝池壁，隨機從不同的4個象限入水點入水1次，每天訓練4次，共訓練5 d。記錄90 s內大鼠自入水至爬上平臺所需時間，即逃避潛伏期。若入水后90 s內未找到平臺，或未爬上平臺，則將大鼠放置于平臺站立10 s后休息30～60 s，再進行下一次訓練。記錄各組大鼠逃避潛伏期和游泳總距離。(2)空間探索實驗。于水迷宮實驗第6天進行空間探索實驗，檢測各組大鼠對原平臺的記憶能力。撤除平臺后，將大鼠從平臺對側象限的中點放入水中，記錄大鼠在90 s內穿越平臺的次數、游泳總距離及在原平臺象限的探索時間。

1.4.2 血清IL-1β、IL6、TNF-α含量檢測：給藥第45天，水迷宮實驗結束后，給予大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，解剖大鼠后經腹主動脈采血2 mL，3 000 r/min離心15 min取血清，分裝置于-20℃保存待測。嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。方法為從-20℃冰箱取出血清，常溫下放置1 h后，3 000 r/min離心15 min后取上清液檢測。樣品孔加入待檢樣品10 μL，依次加入樣品稀釋劑40 μL，相應抗體100 μL，置于37℃孵育1 h，用試劑盒配套洗滌液洗滌5次。每孔加入底物液A、B各50 μL顯色，37℃避光孵育15 min。各反應孔加入終止液50 μL，于酶標儀450 nm下檢測各孔吸光度值。

1.4.3 Nissl染色觀察海馬結構的形態學變化：實驗結束后，腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠并采集血標本后，采用隨機數字表法分別于各組隨機選取7只大鼠，開胸暴露心臟，用生理鹽水(4℃)沖洗血液，再灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液，灌注1 h后立即剝離腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定72 h，將腦組織經冠狀面均勻切成3段，取中間含海馬段腦組織行石蠟包埋，做5 μm厚連續冠狀切片，取石蠟切片進行Nissl染色，于光學顯微鏡下觀察大鼠海馬CA3區神經元的形態學改變。

1.4.4 海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平的檢測：實驗結束后，取各組其余8只大鼠，同法麻醉后剝離腦組織獲取大鼠海馬組織，采用免疫印跡試驗法檢測大鼠海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表達水平。取大鼠海馬組織100～200 mg，提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，制作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后行電泳，電泳結束后將蛋白轉印至硝酸纖維膜，采用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉硝酸纖維膜2 h，一抗(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，TBST洗膜；二抗(1 ∶5 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜，于暗室用發光液孵育膜后，在凝膠成像系統中曝光，采用Image J 軟件分析各條帶灰度值，以β-肌動蛋白為內參，計算目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值。

1.5 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 神經節苷脂鈉對癲癇大鼠定位航行能力的影響 水迷宮實驗期間，與空白組大鼠相比，其他3組大鼠第1～5天的逃避潛伏期均延長；與模型組相比，陽性對照組及神經節苷脂鈉組大鼠逃避潛伏期時間均縮短(均P<0.05)，但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。與空白組相比，其他3組大鼠實驗游泳總距離均增加；與模型組相比，陽性對照組、神經節苷脂鈉組大鼠游泳總距離縮短(均P<0.05)，但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠逃避潛伏期的比較(x±s，s)

表2 各組大鼠游泳總距離的比較(x±s，cm)

2.2 神經節苷脂鈉對癲癇大鼠空間探索能力的影響 水迷宮實驗期間，與空白組大鼠相比，其他3組大鼠在原平臺象限探索有效時間比率及游泳距離比率降低，穿越原平臺次數減少(均P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組及神經節苷脂鈉組大鼠在原平臺象限探索有效時間及游泳距離比率升高，穿越原平臺次數增多(均P<0.05)，但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠原平臺象限探索有效時間比率、游泳距離比率、穿越平臺次數的比較(x±s)

2.3 神經節苷脂鈉對癲癇大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響 與空白組大鼠比較，其他3組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高(均P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、神經節苷脂鈉組IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)；與陽性對照組相比，神經節苷脂鈉組血清TNF-α含量降低(P<0.05)，但兩組IL-1β、IL-6差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量比較(x±s，ng/mL)

2.4 神經節苷脂鈉對大鼠海馬組織神經元形態的影響 Nissl染色可見，空白組大鼠海馬CA3 區神經細胞密度高，排列整齊，尼氏體染色均勻，尼氏小體豐富。模型組大鼠海馬CA3 區可見神經元損傷，細胞核固縮，細胞間隙擴張，結構紊亂，尼氏體出現凝集，數量減少。陽性對照組、神經節苷脂鈉組大鼠的海馬CA3 區異常神經元數量減少，細胞排列比較規律，尼氏體數量較模型組有所增加，神經細胞變性程度較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織神經元形態(Nissl染色，×400)

2.5 神經節苷脂鈉對大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平的影響 與空白組相比，其他3組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白相對表達水平升高(均P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組及神經節苷脂鈉組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平均降低(均P<0.05)，但兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2和表5。

圖2 各組TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達情況

表5 各組大鼠海馬組織中TLR-4-MyD88通路相關蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

癲癇是一種常見的慢性神經系統疾病，是由多種原因引起的腦內神經元反復異常放電，以反復不自主發作為主要臨床特點[1]。經抗癲癇藥物治療后，目前有70%～80%的癲癇患者癲癇發作得到有效控制，但仍有20%～30%的患者治療效果不理想[4]，且臨床常規的抗癲癇藥物也存在頭暈、嗜睡、行為改變等多種不良反應。因此，尋找療效較好且毒副作用小的抗癲癇藥物具有重要的臨床意義。

神經節苷脂是一類從豬腦中提取的具有神經保護作用的生物制劑，常用于腦出血、腦梗死、脊髓損傷及顱腦損傷性疾病的治療[12]。單唾液酸神經節苷脂鈉，即神經節苷脂鈉，是哺乳動物腦組織中神經節苷脂的主要種類。其能夠穿透血腦屏障，修復各種原因引起的中樞神經系統損傷，因而成為藥理學及臨床研究的熱點[5]。臨床研究表明，神經節苷脂鈉注射液能夠有效減輕癲癇患者的癥狀，并能減少常規抗癲癇藥物引起的并發癥，在癲癇的治療上具有良好的應用價值。例如，李小戰[13]的臨床研究顯示，在常規抗癲癇藥物的基礎上應用神經節苷脂鈉注射液能夠更有效控制癲癇發作，改善患者臨床癥狀，對腦外傷癲癇患者療效良好。此外，有研究顯示，神經節苷脂鈉還能夠有效減少癲癇患者常規抗癲癇治療相關不良反應的發生[14]。以上研究結果提示，神經節苷脂鈉在癲癇的治療中具有較大的潛力。但目前關于神經節苷脂鈉抗癲癇作用的機制如何，研究報告較少。

氯化鋰-毛果蕓香堿誘導的癲癇持續狀態大鼠模型主要表現為癲癇反復發作及海馬組織病理學改變，被認為是目前最理想的癲癇動物模型[10]。因此，本研究采用氯化鋰-毛果蕓香堿誘導癲癇持續狀態大鼠模型，探討神經節苷脂鈉側腦室注射對癲癇大鼠認知功能和神經炎癥的作用及其機制。癲癇持續狀態反復發生可引起中樞神經系統損傷，繼而導致不同程度的認知功能障礙，主要包括記憶力減退、學習能力及智力水平下降等改變[15]。現普遍認為位于大腦丘腦和內側顳葉之間的海馬在人的記憶功能中起著重要作用，在認知障礙者中常可見到該區域的病理變化[16]。海馬皮質可劃分為CA1、CA2、CA3、CA4四個部分，其中CAl和CA3與學習、記憶以及認知功能相關。研究表明，癲癇持續狀態可引起海馬CAl及CA3區神經元損傷，并引起海馬組織病理性改變[17]。本研究結果顯示，模型組大鼠水迷宮實驗的逃避潛伏期延長，游泳距離增加，在原平臺象限探索有效時間比率及游泳距離比率降低，穿越原平臺次數減少，表明模型組大鼠出現學習記憶能力下降及隨意運動障礙。癲癇模型病理改變為海馬神經元的丟失，海馬區可見存活神經元和尼氏體含量的減少，通過Nissl染色可觀察神經元的受損程度，本研究的Nissl染色顯示，模型組大鼠海馬CA3 區可見神經元損傷，細胞核固縮，細胞間隙擴張，結構紊亂，尼氏體出現凝集，數量減少，提示模型建立成功。經側腦室注射神經節苷脂鈉后，與模型組比較，大鼠在水迷宮實驗過程中逃避潛伏期及游泳距離縮短，找到平臺時間縮短，穿越原平臺次數增加，且神經元損傷情況減輕，提示神經節苷脂鈉能夠減輕氯化鋰-毛果蕓香堿所致的癲癇持續狀態大鼠的認知功能障礙和神經元損傷。

盡管癲癇所致認知障礙的機制還不十分明確，但許多學者認為神經炎癥反應與其發生和發展密切相關。癲癇發作后能夠促使局部炎性因子分泌，進而迅速引起腦組織炎癥反應，這種現象稱為“神經炎癥”[18]。研究表明，神經炎癥反應能夠引起神經元損傷，促使海馬區域炎癥反應放大并分泌大量炎性因子，從而導致認知功能障礙[19]。有研究顯示，在癲癇動物模型及癲癇患者腦組織中，IL-1β、 IL-6及TNF-α等促炎性細胞因子表達水平均升高，提示癲癇發病可能與炎癥反應有關[20]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高，提示癲癇大鼠體內存在炎癥反應；而與模型組相比，陽性對照組、神經節苷脂鈉組IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)，提示神經節苷脂鈉能夠減輕神經炎癥，從而改善大鼠的認知功能障礙。

TLR-4-MyD88信號通路與癲癇的發生和發展密切相關。TLR-4主要表達于腦組織的星形膠質細胞、小膠質細胞及神經元，可以與脂多糖、IL-1等炎癥因子結合，進一步激活下游信號分子[21]。Maroso等[22]研究發現，癲癇小鼠海馬組織中TLR-4的表達增多，經TLR-4特異性拮抗劑處理后，小鼠癲癇癥狀明顯減輕。NF-κB p65位于TLR通路的下游，與TNF-α、IL-6等多種促炎細胞因子的表達密切相關，是炎癥過程中炎癥介質的重要調節因子[23]。MyD88是TLR-4介導信號通路的關鍵蛋白，能夠促使 NF-κB p65由胞質轉移到胞核，從而發揮轉錄調控作用；其還可以上調 IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達，導致炎性級聯反應，從而加快癲癇的進展[24]。本研究結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠海馬組織TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平升高；與模型組比較，陽性對照組及神經節苷脂鈉組大鼠海馬組織TLR4、NF-κB p65、MyD88蛋白表達水平均降低(均P<0.05)。這提示神經節苷脂鈉能夠有效降低大鼠海馬組織中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表達以減輕神經炎癥，從而發揮保護神經功能的作用。

綜上所述，神經節苷脂鈉能夠減輕氯化鋰-毛果蕓香堿誘導的癲癇持續狀態大鼠的神經炎癥，并改善大鼠認知功能障礙，其作用機制可能與抑制TLR4-MyD88信號通路的激活有關。