紅景天苷靶向VEGF/HIF-1α信號通路調(diào)控缺氧介導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓▲

周爭光 周 勇 常振宇

(1 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬宿州醫(yī)院心血管內(nèi)科，宿州市 234000，電子郵箱：979181923@qq.com；2 西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科技學(xué)院，林芝市 860000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種由多種病因?qū)е路尾縿用}壓超出正常界值的綜合征，主要通過血管收縮、肺血管重構(gòu)來誘發(fā)右心衰竭，導(dǎo)致患者發(fā)生腹水甚至死亡[1]。低氧可以刺激肺動脈平滑肌細(xì)胞異常增殖從而誘發(fā)PAH，而肺血管重構(gòu)是低氧性肺動脈高壓(hypoxia-induced pulmonary hypertension，HPH) 不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因素和血管變化特征。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endo-thelial growth factor，VEGF)又稱為血管通透因子，其在機(jī)體含氧量較低的條件下具有促進(jìn)血管增生的作用[2]。在缺氧環(huán)境下，機(jī)體中VEGF的含量明顯增加，這表明VEGF的表達(dá)受缺氧的調(diào)節(jié)[3-4]。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-induced factor，HIF)-1α是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，肺臟為其作用的主要靶器官。動物實(shí)驗表明，HIF-1α在PHP大鼠肺臟組織中的表達(dá)上調(diào)，由此推測HIF-1α是HPH發(fā)病的關(guān)鍵[4]。HIF-1α可能通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)上調(diào)引起血管腔狹窄，導(dǎo)致肺血管重建等的發(fā)生，從而引發(fā)HPH[5]。

紅景天是一種較為珍貴的野生植物，主要生長在晝夜溫差大的高原地區(qū)，作為中草藥，其具有益氣活血的功效[6]，同時具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防老年癡呆等作用。紅景天苷為紅景天提取物，具有抗缺氧的作用，可用于高原反應(yīng)的治療[7]。李龍等[8]的研究表明，添加一定比例紅景天粉的日糧可顯著增加高原缺氧環(huán)境中肉雞的抗氧化自由基的能力。而HPH是罹患高原肺水腫、高原性心臟病等高原性疾病的初始環(huán)節(jié)。因此，本研究建立HPH大鼠模型，分析紅景天苷對HPH大鼠的干預(yù)效果以及對大鼠體內(nèi)HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究HPH的臨床治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物和分組 選擇90只健康Wistar 大鼠，雌雄各半，30日齡，體重(150±10)g，購自湖北省實(shí)驗動物研究中心(許可證號：2019-0077)。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、模型組、紅景天苷干預(yù)組，每組30只。按常規(guī)飼養(yǎng)條件進(jìn)行飼養(yǎng)，即環(huán)境溫度21℃～27℃，相對濕度為40%～70%，自由攝食和飲水。

1.2 主要儀器與試劑 ProOx-810型低壓低氧艙購自上海塔望智能科技有限公司，3K15型高速冷凍離心機(jī)購自Sigma公司，超微壓力導(dǎo)管購自ADInstruments公司(批號：SPR-864)，BP-28生物信號采集處理系統(tǒng)購自高碑市新航機(jī)電設(shè)備有限公司， Biosignals Professional(8通道)多導(dǎo)儀購自PLUX公司，ChemiDoc XRS+凝膠成像儀購自Bio-Rad公司，Qubit核酸定量儀購自Invitrogen公司，LightCycler 480 PCR儀購自Roche公司。紅景天苷購自上海源葉生物科技有限公司(批號：10338-51-9)；二喹啉甲酸試劑盒購自白鯊生物科技(批號：BL521A)，兔抗鼠多克隆VEGF抗體(批號：A00623)、兔抗鼠多克隆HIF-1α抗體(批號：M00013)、山羊抗兔辣根過氧化物酶-IgG(批號：BA1056)購自武漢博士德生物工程有限公司，內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自ABclonal生物科技有限公司(批號：A19056)，聚偏二氟乙烯膜購自MilliPore公司(批號：IPVH00010)、顯影定影試劑(批號：P0019)購自碧云天公司，電泳緩沖液為自配；TRIzol試劑購自Applygen公司(批號：R1030)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司(批號：AT101)。

1.3 建模和干預(yù)方法 參照文獻(xiàn)[9]的方法建立大鼠HPH模型，將模型組和紅景天苷干預(yù)組大鼠放于低壓低氧艙(大氣壓約為50 kPa，氧濃度約為10%)，每天8 h，其余時間為常壓常氧環(huán)境，持續(xù)4周。進(jìn)入低壓低氧艙的當(dāng)天開始，紅景天苷干預(yù)組每天按32 mg/kg腹腔注射0.2%紅景天苷(用生理鹽水配置)，模型組大鼠腹腔注射0.5 mL生理鹽水，1次/d，持續(xù)4周。兩組均先進(jìn)行低壓低氧干預(yù)，再進(jìn)行藥物干預(yù)，對照組大鼠于常壓常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，未給予任何干預(yù)。

1.4 右心室相關(guān)指標(biāo)和平均肺動脈壓的檢測 實(shí)驗結(jié)束后當(dāng)天，大鼠禁食5 h，然用0.3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉各組大鼠，同時給予肌內(nèi)注射0.1%的阿托品(0.5 mL/100 g)以減少腺體的分泌防止造成氣道堵塞。麻醉成功后，將大鼠固定于操作臺上，首先通過右心導(dǎo)管插入術(shù)將超微壓力導(dǎo)管連接生物信號采集處理系統(tǒng)以測定右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)。測完RVSP后，剝離右頸外靜脈，沿近心端緩慢插入含有10 U/mL肝素的導(dǎo)管，然后結(jié)扎血管，松開止血鉗，由壓力傳感器將壓力信號傳輸給多導(dǎo)儀，于松開止血鉗開始記錄0 h、1 h、2 h、4 h、8 h壓力值，描繪壓力曲線，記錄平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)。測壓后開胸取心臟，并稱取右心室重量和左心室加室間隔的重量，右心室肥厚指數(shù)=右心室重量/左心室加室間隔的重量，稱量完畢后將心臟組織放于10%福爾馬林固定液中固定24 h。

1.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗檢測VEGF和HIF-1α蛋白的表達(dá) 取各組大鼠肺組織分別置于已預(yù)冷的RIPA裂解液和PMSF抑制劑中(RIPA與PMSF體積比為1 ∶100，共0.5 L)，組織勻漿，提取蛋白，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用二喹啉甲酸試劑盒測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，變性10 min。每孔加樣3 μL，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，采用含5%的脫脂奶粉封閉液封閉膜3 h后，滴加一抗(稀釋體積比為1 ∶500，抗體用TBST稀釋)，4℃過夜，用TBST于室溫下漂洗5 min×4次。以山羊抗兔辣根過氧化物酶-IgG為二抗(稀釋體積比為1 ∶5 000，抗體用TBST稀釋)，37℃孵育2 h，用TBST于室溫下漂洗5 min×4次。滴加ECL發(fā)光液孵育1～2 min，放入凝膠成像儀中曝光成像。并利用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測VEGF mRNA和HIF-1α mRNA的表達(dá) 采用常規(guī)TRIzol法提取不同組小鼠肺組織總RNA，用核酸定量儀對RNA的純度和濃度進(jìn)行檢測，將檢測合格的RNA(A260/A280=1.8～2.1)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃。通過GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)獲取內(nèi)參基因GAPDH及目的基因VEGF、HIF-1α的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由北京擎科生物科技有限公司合成引物，引物序列見表1。用LightCycler 480 PCR儀檢測VEGF、HIF-1α mRNA相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA 2 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各1 μL，2×Master Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性15 min；95℃變性10 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠右心室相關(guān)指標(biāo)的比較 模型組、紅景天苷干預(yù)組大鼠的RVSP和右心室肥厚指數(shù)均高于對照組，但紅景天苷干預(yù)組大鼠的RVSP和右心室肥厚指數(shù)均較模型組下降(均P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠RVSP和右心室肥厚指數(shù)的比較(x±s)

2.2 各組大鼠各時間點(diǎn)mPAP的比較 連續(xù)監(jiān)測8 h內(nèi)，各個時間點(diǎn)模型組的mPAP均高于對照組，而除1 h時外，其他各個時間點(diǎn)紅景天苷干預(yù)組的mPAP均低于模型組(均P<0.05)。見表3。

表3 3組小鼠各個時間點(diǎn)mPAP的比較(x±s,mmHg)

2.3 各組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組、紅景天苷干預(yù)組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白的相對表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與模型組相比，紅景天苷干預(yù)組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α 蛋白的相對表達(dá)水平降低(均P<0.05)。見表4和圖1。

表4 3組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

圖1 各組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α蛋白的表達(dá)情況

2.4 各組大鼠肺組織VEGF和HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組、紅景天苷干預(yù)組大鼠肺組織 VEGF、HIF-1α mRNA 的相對表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與模型組相比，紅景天苷組大鼠肺組織VEGF mRNA的相對表達(dá)水平降低(均P<0.05)，但是紅景天苷干預(yù)組與模型組大鼠肺組織的HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 3組大鼠肺組織VEGF、HIF-1α mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

近年來，眾多國內(nèi)外學(xué)者對HPH的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了深入研究,現(xiàn)在普遍認(rèn)為HPH的發(fā)生有兩大關(guān)鍵點(diǎn)：一是前期低氧性肺血管收縮，二是后期肺血管重建[10]。但至今其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HPH的發(fā)生由多方面原因造成，例如離子通道活性被激活或抑制、氧不充足時導(dǎo)致?lián)p傷、多基因調(diào)控等因素[11]。多個研究表明，HPH的發(fā)生與機(jī)體缺氧密不可分，而在其中起關(guān)鍵作用的是VEGF和HIF。例如，桑葵等[5]研究發(fā)現(xiàn)，新生HPH大鼠的肺組織中HIF-1α mRNA表達(dá)上調(diào)，HIF-1α在HPH的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用；李福祥等[12]的研究結(jié)果顯示，在低氧情況下，大鼠體內(nèi)肺動脈細(xì)胞的HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)量都超過正常范圍。王娟梅等[13]指出，缺氧的新生鼠體內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)水平升高，并且和低氧時長呈正相關(guān)；Tuder等[14]研究發(fā)現(xiàn)，重度PAH患者存在肺動脈血管內(nèi)皮損傷，且肺動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中HIF-1α與VEGF的mRNA表達(dá)量增加； Christou等[15]的研究表明，大鼠生存于10%低氧環(huán)境1～3周，肺內(nèi)的VEGF mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，肺動脈、支氣管末梢上皮、平滑肌細(xì)胞和肺泡內(nèi)的VEGF蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)；如果缺乏HIF-1α的表達(dá)，VEGF mRNA水平顯著降低，且即使在低氧條件下，VEGF mRNA也未被誘導(dǎo)表達(dá)[16]。

本研究采用低壓低氧法建立大鼠HPH模型，4周后模型組大鼠RVSP和mPAP較對照組增加，這表明利用低壓低氧法成功構(gòu)建HPH大鼠模型。紅景天苷具有消腫止痛、減緩衰老、抗缺氧、加快血管血液流動[17]，以及減慢疲勞程度、清除自由基、調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)系統(tǒng)、緩解肌肉抽搐的功能[18-19]。結(jié)合HIF-1α的作用，我們推測這些功能可能與HIF-1α的生物調(diào)節(jié)有一定聯(lián)系。因此，我們利用紅景天苷干預(yù)HPH大鼠，觀察其干預(yù)效果，并通過檢測肺組織VEGF和HIF-1α的表達(dá)探討其可能的干預(yù)機(jī)制。結(jié)果顯示，相比于模型組大鼠，紅景天苷干預(yù)組大鼠mPAP和右心室肥厚指數(shù)均降低，這表明紅景天苷能有效控制HPH的發(fā)展。另外，模型組大鼠肺組織中VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)均上調(diào)，與既往研究[12,14]結(jié)果相似；而紅景天苷干預(yù)組大鼠肺組織中VEGF mRNA和蛋白、HIF-1α蛋白相對表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。由此推測：紅景天苷通過下調(diào)HIF-1α蛋白的表達(dá)間接抑制HIF-1α上調(diào)下游靶基因VEGF蛋白的作用，降低缺氧對內(nèi)皮細(xì)胞的損壞，改善肺動脈血管收縮、舒張因子的動態(tài)失衡，并降低肺血管平滑肌增殖，抑制肺血管重構(gòu)，從而有效遏制HPH的發(fā)展。

綜上所述，紅景天苷可能通過下調(diào)肺組織血管收縮因子HIF-1α和VEGF水平，從而干預(yù)HPH的發(fā)展，但是其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。