載吲哚美辛嵌段聚合物膠束的表征、釋藥性能及血液相容性*

鞏志強，李 欣，符佳樂，郭光惠，王小寧

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

心腦血管疾病是當今致死性疾病之首，嚴重威脅著人類的生命健康，中國死于中風等心腦血管性疾病的人數已超過250萬/a。血栓栓塞是多種心腦血管疾病發病的原因，其形成具有多種機制，其中動脈硬化、血管內皮損傷、內外凝血系統異常或血流動力學異常等是主要的誘發原因[1]。吲哚美辛(indometacin，IDM)為常用的非甾體抗炎藥，具有抗炎、解熱及鎮痛作用，對環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)有非特異性抑制作用。研究表明，吲哚美辛可抑制血小板凝集，與肝素等抗凝藥聯合使用可以發揮抗血栓協同作用[2]。由于吲哚美辛的溶解度很低(水溶液中0.02 mg/mL)，吲哚美辛普通制劑如片劑、膠囊劑等生物利用度低，長期口服會產生對胃腸道有較強的刺激性，容易引發消化道出血、潰瘍等不良反應，因此，設計開發吲哚美辛新型制劑以增加溶解度、提高生物利用度以及減少不良反應至關重要[3]。

嵌段聚合物膠束是由兩親性嵌段共聚物在水中自組裝形成的一種分子聚集體，具有“核-殼”結構，親水段形成外殼，疏水段形成膠束的內核[4]。使用嵌段聚合物膠束可將疏水性吲哚美辛藥物包裹于膠束內核中，有望增大吲哚美辛的溶解度，減小刺激，提高生物利用度[5]。聚(2-乙基-2-噁唑啉)[poly(2-ethyl-2-oxazoline)，PEOz]是一種親水性高分子材料，可以作為膠束的親水段使用，同時其生物相容性好，已通過美國食品與藥品管理局的認證[6]。PEOz鏈形成的親水外殼可形成立體位阻，使膠束避免被攝取清除，因此能夠延長藥物的體內循環時間[7]。作者合成雙嵌段共聚物聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(PEOz-PLA)，包載IDM構建納米膠束體系，研究該膠束的理化性質、體外釋藥性質及血液相容性，為IDM的新劑型研究提供依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-乙基-2-噁唑啉(EOz)：純度大于99%，北京百靈威科技有限公司；對甲苯磺酸甲酯(MeOTs)：純度大于99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D，L-丙交酯(D,L-LA)：純度大于99%，濟南岱罡生物科技有限公司；異辛酸亞錫、乙腈、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、丙酮：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；高純氮氣：純度大于99.999%，由西安醫學院實驗中心提供；吲哚美辛：藥用級，純度大于99%，上海英索生物科技中心；新西蘭兔：雌性，200～250 g，成都達碩實驗有限公司。

智能磁力攪拌器：ZNCL-BS-X19，鞏義市瑞力儀器設備有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司；傅里葉紅外光譜儀：T-27，德國BRUKER公司；超聲波清洗器：KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司；紫外-可見分光光度計：Cary60，安捷倫科技(中國)有限公司；臺式高速離心機：H1850，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；旋轉蒸發儀：R201L，上海譜振生物科技有限公司；激光粒度分析儀：ZEN-3600，馬爾文儀器公司；電子分析天平：AX224ZH，美國奧豪斯公司；真空干燥箱：DZF6050，上海一恒科學儀器有限公司；pH計：PHS-3C，上海雷磁儀電儀器公司；透射電子顯微鏡，FEI-TECNAI：荷蘭Philips公司。

1.2 PEOz-PLA的合成

采用陽離子開環聚合法合成PEOz-OH[8]。具體操作如下。EOz、MeOTs和乙腈用氫化鈣除水，備用。取30.36 g EOz和6.55 g MeOTs(引發劑)置于雙口圓底瓶中，加入100 mL乙腈，氮氣保護、t=100 ℃攪拌反應36 h，冷卻至室溫，加入KOH甲醇溶液0.1 mol/L，48 mL，室溫攪拌反應2 h。將反應液置于單口圓底瓶中，旋蒸除去有機溶劑，加入80 mL三氯甲烷復溶，布氏漏斗抽濾除去不溶性鹽，重復多次，以徹底除去生成的對甲苯磺酸鹽。旋蒸除去有機溶劑，加入10 mL四氫呋喃復溶，逐滴加入到劇烈攪拌的冷無水乙醚中，析出沉淀，抽濾，得到白色沉淀，真空干燥24 h，得PEOz-OH。將D,L-LA用乙酸乙酯重結晶3次，室溫下真空干燥24 h。將PEOz-OH置于100 mL圓底燒瓶中，加入約70 mL甲苯，采用分水器共沸除水，使揮發出來的甲苯變澄清后停止加熱。加入需要量重結晶后的D,L-LA和催化劑辛酸亞錫[m(辛酸亞錫)∶m(D，L-LA)=0.5%]，氮氣保護、t=140 ℃反應36 h。旋蒸除去有機溶劑，用二氯甲烷復溶，逐滴加入劇烈攪拌的冷乙醚中，析出沉淀，抽濾，得到白色固體，真空干燥24 h，得到PEOz-PLA，合成路線見圖1。

圖1 PEOz-PLA的合成路線圖

1.3 聚合物材料的結構表征

將少量PEOz-PLA溶解于CDCl3中，以TMS為內標在室溫下測定聚合物的1H NMR譜，根據譜圖計算PEOz-OH和PEOz-PLA的分子量。

1.4 膠束的粒徑、分布及形態

1.4.1 空白膠束溶液的制備

采用溶劑揮發法制備空白膠束。精密稱取10 mg PEOz-PLA材料溶解于1 mL三氯甲烷中，超聲溶解形成聚合物溶液。向50 mL燒杯中加入10 mL水，置n=700 r/min攪拌，用1 mL注射器吸聚合物溶液以15滴/min的速度滴入水中，滴加完畢后攪拌10 min，40 ℃旋蒸除去溶液中的三氯甲烷，用220 nm濾膜過濾得到聚合物PEOz-PLA膠束溶液。

1.4.2 載藥膠束溶液的制備

精密稱取1 mg IDM溶解于1 mL甲醇之中，得到質量濃度為1 mg/mL的藥物溶液，在劇烈攪拌下，將1 mL藥物溶液加入到10 mLρ(空白膠束)=1 mg/mL溶液中，繼續劇烈攪拌4 h，t=40 ℃旋蒸除去溶液中的三氯甲烷，用0.22 μm微孔濾膜過濾得到載藥膠束溶液。

1.4.3 膠束的粒徑、分布及形態

采用馬爾文激光粒度測定儀測定空白膠束溶液及載藥膠束溶液的粒徑及PDI值。其中多分散度表示粒子分散的均勻程度，其數值越小，表明粒子的分散程度越均勻。每個制劑的結果為3次測定結果的平均值。

用透射電子顯微鏡觀察載藥聚合物膠束的形態。取一滴1.4.2方法的載藥膠束溶液滴于鍍有碳膜的銅網上，2 min后取出銅網，從銅網邊緣吸除多余液體，將銅網晾干后即可放入透射電鏡中觀察。

1.5 IDM的含量測定方法學考察

1.5.1 標準曲線的繪制

精密稱取IDM對照品5.0 mg于100 mL容量瓶中，加入丙酮50 mL，振搖10 min，溶解，磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)稀釋至刻度，制成50 μg/mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液，配制質量濃度梯度為10、15、20、25、30、35 μg/mL的系列溶液，在320 nm波長處，測定吸光度A，以吸光度A為縱坐標，質量濃度ρ為橫坐標，繪制標準曲線。

1.5.2 精密度實驗

取ρ(IDM)=20 μg/mL溶液，按照1.5.1方法測定條件連續測定6次吸光度值，計算RSD值。

1.5.3 穩定性實驗

取ρ(IDM)=20 μg/mL溶液，分別在0、2、4、6、12 h按照1.5.1方法測定條件測定吸光度值，計算RSD值。

1.5.4 加樣回收率實驗

分別取10、20、30 μg/mL系列質量濃度IDM標準溶液(n=3)，加入處方比例的空白膠束材料，超聲分散，加蒸餾水定容，按照1.5.1項測定條件測其吸光度值，計算樣品在低、中、高質量濃度范圍內的回收率及RSD值。

1.6 包封率、載藥量的測定

按照1.4.2方法制備載藥膠束溶液，載藥后的溶液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾膜用20 mL丙酮溶液洗脫，收集洗脫液，按照1.5測定方法，測定洗脫液中ρ(IDM)，計算游離IDM的質量，包封率計算見公式(1)。濾液(載藥膠束)進行冷凍干燥，測得載藥膠束總質量，載藥量計算見公式(2)。

包封率=m(含藥)/m(藥總投入量)×100%

(1)

載藥量=m(含藥)/m(總載藥膠束)×100%

(2)

1.7 體外藥物釋放

精密吸取1.4.2方法載藥膠束溶液10 mL置于透析袋(截留相對分子質量3 500)內，封緊兩端，置于100 mL的磷酸緩沖液(pH=7.4)中，加入1滴吐溫80，t=37 ℃、n=100 r/min于恒溫搖床中振蕩。分別于1、2、4、6、8、10、12 h取出釋放液，每次取3 mL，同時補充3 mL的新鮮釋放介質。取出的釋放介質經0.22 μm的濾膜濾過后，用1.5.1方法測定IDM的含量，計算累積釋放率(Q)，見公式(3)。

(3)

式中：Cn(mg/mL)為不同取樣點的釋放液質量濃度，Ci(mg/mL)為每個取樣點的取樣液質量濃度，V(mL)為釋放介質體積，Vi(mL)為取樣體積，m(mg)為總藥量。

1.8 體外溶血實驗

按照文獻[9]方法制備體積分數2%紅細胞懸液。取7個試管分別加入不同體積的溶液，1～5號管加供試品溶液(終濃度分別為1、10、50、100、150 mg/mL的PEOz-PLA材料溶液)，以生理鹽水為陰性對照組，蒸餾水為陽性對照組。將各管輕輕混勻后，置于37 ℃恒溫水浴中進行孵育，分別于0.5、1、2、3、4、6、8、12 h對試管內液體進行離心(3 000 r/min，5 min)，取上清液于416 nm處用紫外-可見分光光度計測定吸收度(A)，溶血率計算見公式(4)。溶血實驗結果見表1。

表1 溶血實驗表

溶血率=(A樣品-A陰性)/(A陽性-A陰性)

(4)

2 結果與討論

2.1 結構表征

PEOz-PLA的核磁共振氫譜圖見圖2。

由圖2可知，δ=1.14為PEOz-OH側鏈—CH3上質子的化學位移峰，δ=1.56為PLA的—CH3上質子的化學位移峰，δ=3.46、δ=2.41分別為PEOz-OH主鏈及側鏈的—CH2—上質子的化學位移峰，δ=3.04mPEOz-OH主鏈末端—CH3上質子的化學位移峰，δ=5.21為PLA的—CH—上質子的化學位移峰。PEOz-OH的分子量由端甲基上的質子峰(δ=3.02)與側鏈上的甲基質子峰積分面積比得出。見公式(5)。

δ

MPLA=72(MPEOz/99)/(EOz/LA)

(5)

通過積分面積比計算PLA的分子量。根據計算，實驗合成的聚合物分子量為PEOz1 000-PLA1 500。

2.2 粒徑、分布和形態

空白膠束和載藥膠束的粒徑分布見圖3。

d/nma 空白膠束

由圖3可知，空白膠束的粒徑較小，為(73.5±10.2)nm，載藥后，由于內核中裝載藥物，粒徑顯著增大，為(137.8±23.4)nm，空白膠束和載藥膠束的多分散系數PDI均小于0.3，說明膠束分散性較好，粒徑均一。

采用透射電鏡觀察載藥膠束的形態，結果見圖4。

圖4 載藥膠束的透射電鏡圖

由圖4可知，形成聚合物膠束的內核部分由于包載了藥物，呈暗黑色，聚合物膠束呈圓球形，粒徑約為100 nm。與激光粒度儀測定的粒徑結果相比，透射電鏡測得的粒徑偏小，這可能由于激光粒度儀測定的為粒子外層水合后的粒徑，因此透射電鏡的測試結果是客觀的[10]。

2.3 包封率和載藥量

2.3.1 吲哚美辛含量測定方法學考察

以吸光度(A)為縱坐標，質量濃度(ρ)為橫坐標繪制標準曲線，得標準曲線方程為A=0.019+0.012，r=0.999 9，表明IDM在ρ=10.0～35.0 μg/mL峰面積與質量濃度線性關系良好。精密度實驗、穩定性實驗的RSD值為0.68%和1.26%，說明t<12 h樣品溶液穩定。

按照1.5.4的方法進行加樣回收率實驗，得到的回收率結果見表2。

表2 加樣回收率實驗

由表2可知，樣品在低、中、高質量濃度范圍內回收率均為90%～110%，RSD值均小于5%，表明該測定方法回收率良好。

2.3.2 包封率和載藥量結果

按1.6的公式計算載藥膠束的包封率為(75.40±5.28)%，載藥量為(15.61±4.67)%。

2.4 體外藥物釋放

載藥膠束的體外釋藥曲線見圖5。

t/h

由圖5可知，t=2、4 h時載藥膠束的累計釋放百分數分別為(50.06±2.79)%、(59.82±4.56)%，存在一定的突釋現象，t=12 h，載藥膠束的釋放度為(66.29±4.61)%，t=24 h，載藥膠束的累計釋放度為(81.18±3.59)%，且釋藥時間可長達48 h，因此，載藥膠束具有較好的緩釋效果。這是由于嵌段共聚物膠束內核為疏水性，與吲哚美辛間具有較強的內聚力，可延緩藥物從核心向外的擴散，使其釋藥速率十分緩慢[11]。

對載藥膠束的釋放過程分別進行零級、一級和Higuchi方程擬合，得出釋藥方程見表3。

表3 擬合結果

由表3可知，載藥膠束的藥物體外釋放過程符合Higuchi方程(r2接近1)，說明藥物通過擴散的方式進行釋放。

2.5 體外溶血實驗

通過靜脈注射藥物時，膠束材料將與血液中大量的血紅細胞接觸。因此，通過體外溶血實驗研究膠束材料的血液相容性非常必要[12]。不同質量濃度的膠束材料的溶血實驗結果見圖6。

t/h

由圖6可知，隨著ρ(膠束材料)的增大，溶血率逐漸增大，ρ(膠束材料)=150 mg/mL時，與血液接觸0.5 h，溶血率即達到(91.87±1.23)%，當ρ(膠束材料)=1 mg/mL時，接觸24 h時，溶血率均小于5%。這些結果表明，ρ(膠束材料)≤1 mg/mL具有良好的血液相容性，該質量濃度滿足給藥的要求，因此研究制備的載藥制劑具有通過靜脈內注射治療血栓的潛力。

3 結 論

(1)研究合成了PEOz-PLA聚合物材料，制備的空白膠束的粒徑較小，為(73.5±10.2)nm，載藥后粒徑顯著增大，為(137.8±23.4)nm，空白膠束和載藥膠束的PDI均小于0.3，說明膠束分散性較好，粒徑均一；

(2)載藥膠束的包封率為(75.40±5.28)%，載藥量為(15.61±4.67)%，載藥膠束具有較好的緩釋效果，體外釋放符合Higuchi方程；

(3)體外溶血實驗結果表明，ρ(膠束材料)≤1 mg/mL具有良好的血液相容性，制備的載藥制劑具有通過靜脈內注射治療血栓的潛力。