山奈酚羥丙基-β-環糊精包合物的制備與評價*

劉樂樂，楊禮誠，李冬影，閆紫薇，雷夢甜，楊黎燕，張 彥

(1.西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021；2.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 西安 712100)

山奈酚(Kaempferol)，又名山奈素、四羥基黃酮、百蕊草素Ⅲ等，屬黃酮醇類化合物，結構中的二苯基丙烷使山奈酚具有疏水性特點，羥基與氫自由基的結合增強了山奈酚的抗氧化活性[1-4]。最新研究表明，山奈酚具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增強機體免疫等多種藥理作用[5]。山奈酚為黃芪-藿香-金銀花配伍的第二活性化合物，其對甲型流感通路、糖基化終末產物-糖基化終末產物受體(AGEs-RAGE)信號通路、白介素-17信號通路等有一定的調節作用，可能會在新冠病毒的預防及治療方面有廣闊的應用前景[6-7]。

羥丙基-β-環糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HP-β-CD)是對β-環糊精進行結構修飾后的水性衍生物，是β-環糊精與1，2-環氧丙烷縮合而成的親水性衍生物。與藥物進行包合后，可大大提高藥物在水中的溶解度，增加藥物的穩定性和生物利用度。與β-環糊精相比較，水溶性大大提高，且表面活性低，對人體胃腸道、皮膚、眼睛刺激性較小、溶血活性低，不易在體內蓄積。現已有多種羥丙基-β-環糊精包合物制成的口服藥物、注射劑、鼻腔給藥、眼部及舌下給藥等多種藥物劑型[8-9]。

實驗采用溶液-攪拌法制備山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物，對其進行物相鑒定，并考察其還原能力及不同pH下的釋藥性能。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

山奈酚：標準品，純度≥98%，辰光生物科技有限公司；羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)：山東恒臺新大精細化工有限公司；無水乙醇：天津市科密歐化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純；實驗用水為蒸餾水。

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司；超聲波清洗器：PS-40A，上海甄明科學儀器有限公司；離心機：TDL-40B，上海安亭科學儀器廠；恒溫磁力攪拌器：B11-2，上海司樂儀器有限公司；酶標儀：ReadMax1900，上海閃譜生物科技有限公司；冷凍干燥儀：FD-1，鄭州長城科工貿有限公司；紫外分光光度計：UV-6000T，上海元析儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀：EQUINOx55，德國Bruker公司；熔點儀：RY-1G，上海佳航儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山奈酚含量測定方法的建立

1.2.1.1 檢測波長的確定

分別將羥丙基-β-環糊精的水溶液和山奈酚的無水乙醇溶液在200～600 nm波長進行紫外光譜掃描，選擇山奈酚最大吸收波長，且羥丙基-β-環糊精無吸收處作為檢測波長。

1.2.1.2 標準曲線的繪制

精密稱定山奈酚標準品10 mg，加無水乙醇定容于100 mL容量瓶得100 μg/mL山奈酚母液備用。分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的山奈酚母液于25 mL容量瓶，無水乙醇定容至刻度，得2～12 μg/mL系列質量濃度梯度的山奈酚溶液，無水乙醇作空白，于1.2.1.1選定的波長處平行測定3次不同質量濃度下山奈酚乙醇溶液的吸光度。以各質量濃度的平均吸光度為縱坐標，山奈酚質量濃度為橫坐標，繪制山奈酚標準曲線，得回歸方程[10]。

1.2.1.3 回收率試驗

在25 mL容量瓶中分別加入上述100 μg/mL山奈酚母液0.5 mL、1.5 mL、3.0 mL，加入適量羥丙基-β-環糊精，無水乙醇定容，最大吸收波長處測定吸光度，每個質量濃度平行測定3次，根據標準曲線計算出溶液中山奈酚實際質量濃度并取平均值，以質量濃度平均值計算回收率[11]。

1.2.1.4 精密度實驗

25 mL容量瓶中分別加入上述100 μg/mL山奈酚母液0.5、1.5、3.0 mL，加入適量羥丙基-β-環糊精，無水乙醇定容，山奈酚最大吸收波長處測吸光度，每個質量濃度平行測定3次，根據標準曲線計算溶液中山奈酚質量濃度，分別在當天4 h、8 h測定其吸光度，計算山奈酚的實際質量濃度，得出日內精密度；分別于24 h、48 h測定吸光度，帶入回歸方程得山奈酚質量濃度計算日間精密度。

1.2.2 制備包合物

精密稱取100 mg山奈酚，適量無水乙醇溶解，以n(羥丙基-β-環糊精)∶n(山奈酚)=2∶1稱取羥丙基-β-環糊精于圓底燒瓶中，10 mL蒸餾水溶解，60 ℃恒溫磁力攪拌下，將山奈酚的乙醇溶液逐滴加入到HP-β-CD水溶液中，攪拌3 h，放至室溫，離心，上清液冷凍干燥，得山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物[12]。

1.2.3 包合物的鑒定

1.2.3.1 紫外光譜(UV)的鑒定

分別取適量山奈酚、羥丙基-β-環糊精、山奈酚與羥丙基-β-環糊精的物理混合物和山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物，無水乙醇溶解，定容至10 mL容量瓶中，蒸餾水為空白，于200～600 nm波長進行紫外光譜掃描。

1.2.3.2 紅外光譜(IR)的鑒定

分別取山奈酚、羥丙基-β-環糊精、山奈酚與羥丙基-β-環糊精的物理混合物和山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物適量，經KBr壓片，記錄傅立葉紅外光譜[13]。

1.2.3.3 熔點的測定

分別測定山奈酚、羥丙基-β-環糊精及山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物熔點。熔封的毛細管取少量樣品于管底，放入熔點儀觀察，記錄樣品開始熔化至完全熔化的溫度，確定熔程。

1.2.4 羥丙基-β-環糊精對山奈酚的增溶作用

精密稱取適量羥丙基-β-環糊精，配得0.01 mol/L羥丙基-β-環糊精水溶液。精密量取0.01 mol/L的羥丙基-β-環糊精水溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于6個錐形瓶中，分別加入10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、0.0 mL蒸餾水，配得10 mL濃度分別為0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mmol/L的羥丙基-β-環糊精水溶液。分別加入過量山奈酚，超聲10 min，密封，置于恒溫振蕩器，轉速150 r/min，避光振蕩48 h，靜置，上清液過0.45 μ濾膜，濾液于最大吸收波長處測吸光度，計算山奈酚質量濃度及增溶倍數。分別于25、37、45 ℃溫度下平行測定3組山奈酚包合物的增溶倍數。以羥丙基-β-環糊精的質量濃度為橫坐標，山奈酚質量濃度為縱坐標，繪制3個溫度下的相溶解度圖。根據Higuchi的分類法確定相溶解度圖類型，分析包合反應的發生，確定包合比。

1.2.5 體外釋藥動力學分析

采用動態透析法，分別選擇pH=1的鹽酸溶液、pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液為釋放介質，取包合物100 mg于預先處理好的透析袋中，兩端系緊，投入40 mL釋放介質中，于37 ℃恒溫磁力攪拌器80 r/min攪拌，分別于0.5、1、4、8、18、24、48 h取樣4 mL，每次取樣后補加同溫度等體積的釋放介質，最大吸收波長測定取樣吸光度，計算山奈酚濃度及釋放率，繪制體外釋藥曲線[14]。

1.2.6 還原能力的測定

稱取適量包合物、山奈酚標準品，分別配得相當于山奈酚質量濃度為4、8、12、16、20 μg/mL的乙醇溶液，以同質量濃度的維生素C醇溶液為參比，測定其還原能力。取0.4 mL待測液，加入0.4 mL的質量分數1%鐵氰化鉀，混勻，50 ℃水浴20 min，加0.4 mL質量分數10%三氯乙酸，混勻，離心10 min(8 000 r/min)取上清液0.1 mL，加0.1 mL蒸餾水、15 μL質量分數0.1%三氯化鐵，混勻靜置10 min，取200 μL于96孔板，酶標儀700 nm波長處測得吸光度，平行測定3組，取平均值，以蒸餾水代替待測液測定空白吸光度，以吸光度大小評價藥物的還原能力。

2 結果與討論

2.1 山奈酚含量測定方法的建立

2.1.1 檢測波長的確定

山奈酚和羥丙基-β-環糊精的紫外吸收光譜掃描見圖1。

波長/nm

由圖1可知，山奈酚乙醇溶液在367 nm處有最大吸收，HP-β-CD水溶液在此處基本無吸收。

因此以367 nm為山奈酚含量測定的檢測波長。

2.1.2 標準曲線的繪制

按1.2.1.2方法，得到山奈酚標準回歸方程y=0.080 2x-0.023 7，R2=0.999 2，山奈酚標準溶液質量濃度在2～12 μg/mL與吸光度呈現良好線性關系。

ρ/(μg·mL-1)

2.1.3 回收率實驗

回收率實驗結果見表1。

表1 回收率實驗結果

由表1可知，平均回收率為(99.41±0.65)%，變異系數為0.56%。該檢測方法穩定，準確，可用于山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物中山奈酚的含量測定。

2.1.4 精密度實驗

精密度實驗結果見表2。

表2 日內精密度和日間精密度

由表2可知，檢測3個濃度的山奈酚溶液，其日內、日間變異系數RSD均小于3%，符合藥典要求，該檢測方法穩定性準確性較好，可用于山奈酚-羥丙基-β-環糊精中山奈酚的含量測定。

2.2 包合物的鑒定

2.2.1 紫外光譜(UV)的鑒定

山奈酚、山奈酚與羥丙基-β-環糊精的物理混合物、山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物及羥丙基-β-環糊精的紫外吸收光譜圖見圖1。

由圖1可知，山奈酚、山奈酚與羥丙基-β-環糊精的物理混合物、山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物均在367 nm有一穩定而強烈的吸收峰、在339 nm處有一小尖銳的峰，而羥丙基-β-環糊精在367 nm處無吸收峰。由于山奈酚被包載于羥丙基-β-環糊精的內部空腔中，包合物在300～400 nm處的紫外吸收值大幅降低，比山奈酚和物理混合物的吸收峰均有大幅度降低，因此可以推斷山奈酚與羥丙基-β-環糊精發生了包合作用。在形成包合物時，羥丙基-β-環糊精結合山奈酚為非共價鍵形式。

2.2.2 紅外光譜(IR)的鑒定

羥丙基-β-環糊精、山奈酚、山奈酚與羥丙基-β-環糊精的物理混合物及山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物的紅外吸收光譜圖見圖3。

波數/cm-1

2.2.3 熔點的測定

熔點測定結果顯示，山奈酚熔程為246～251 ℃，羥丙基-β-環糊精熔程為263～273 ℃，物理混合物熔程為251～266 ℃，包合物熔程為271～275 ℃。包合物的熔點與物理混合物相比較熔程顯著縮短，并與山奈酚及物理混合物皆有差異，初步表明有新的物相生成。

2.3 體外釋藥動力學分析

包合物在pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液的釋藥曲線見圖4。

t/h

由圖4可知，山奈酚-丙基-β-環糊精包合物在pH=6.8磷酸鹽緩沖溶液中，前8 h釋藥較快，24 h后逐漸達到釋藥平衡，但釋藥率僅47.19%，表明該包合物在pH=6.8的環境中釋藥率較差。對此釋藥曲線分別用零級釋放方程(Mt/M∞=kt)，一級釋放方程(Mt/M∞=1-e-kt)，Higuchi方程(Mt/M∞=kt0.5)，Ritger-Peppas方程(Mt/M∞=ktn)進行擬合，擬合結果見圖5和表3。由圖5、表3可知，此包合物在pH=6.8的環境中釋藥曲線符合一級模型方程(R2=0.974 17)，表明此包合物中包載藥物的釋放與時間呈現正相關。

t/h

表3 包合物在pH=6.8釋放介質中的釋藥擬合結果

包合物在pH=1的介質中釋藥曲線見圖6。

t/h

由圖6可知，山奈酚-羥丙基-β-環糊精包合物在pH=1的釋放介質中，釋藥率與時間呈指數正相關，24 h內藥物釋放較快，48 h釋藥率可達84.89%，表明該包合物在pH=1的環境中釋藥率較好。

對此釋藥曲線分別用零級釋放方程(Mt/M∞=kt)，一級釋放方程(Mt/M∞=1-e-kt)，Higuchi方程(Mt/M∞=kt0.5)，Ritger-Peppas方程(Mt/M∞=ktn)，擬合結果見圖7和表4。

t/h

表4 包合物在pH=1釋放介質中的釋藥擬合結果

由表4可知，此包合物在pH=1的環境中釋藥曲線符合一級動力學模型方程(R2=0.993 68)，即此包合物的體外釋放量在單位時間內按恒定的比例釋放。

2.4 還原能力的測定

不同濃度下山奈酚、包合物及維生素C的還原能力對比見圖8。

ρ(藥物濃度)/(μg·mL-1)

由圖8可知，山奈酚、包合物及維生素C在700 nm的吸光度隨著藥物質量濃度的增大而增強，表明還原鐵離子能力與質量濃度呈正比關系。山奈酚被包合后仍具有還原能力，且還原能力與未包合的山奈酚相當，略有增大。兩者與陽性對照維生素C相比略低。

3 結 論

制備的包合物經紫外圖譜、紅外圖譜、熔點鑒定結果表明，山奈酚與羥丙基-β-環糊精的包合并非簡單的物理混合，山奈酚被包載于羥丙基-β-環糊精中；包合物的體外釋藥動力學實驗表明，包合物在pH=1的鹽酸溶液中釋藥性能較好，釋藥率隨著時間延長而增大直至達平衡，48 h釋藥率可達84.89%。包合物在pH=1和pH=6.8條件下釋藥曲線均對一級動力學方程擬合較好，但其緩釋性能的差異還有待考察；包合物與山奈酚還原能力測定結果顯示，包合物與單純未包合的山奈酚相比，還原能力相當，該包合物具有一定的研究意義。